植物内生菌DNA提取方法.doc

在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。
植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。
东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。
1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。
2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。
4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6. 加入200μL 5 M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。
7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），彻底混匀，12000×g离心10 min。
8. 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。
9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6 vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1 h。
10. 4℃，12000×g离心10 min，弃上清。
11. 沉淀用70 %冰乙醇清洗，离心，弃上清。
12. DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。
13. DNA纯化采用TIANquick Midi Purification Kit。

微生物16S rRNA基因 V5-V6-V7区域扩增引物：
799F2：GATGG CCATT ACGGC CNNNN NN
1193R：ACGCA TCCCC ACCTT CCTC
用含10 % SDS提取缓冲液(NaP缓冲液)重新悬浮细胞团块。用直径0.11mm的玻璃珠珠打操作50 s，以溶解细胞。用苯酚-Tris (pH 8)溶液和氯仿/异戊醇提取，用0.6 vol的异丙醇和0.5 mol/L NaCl通过沉淀再次获得DNA。用70 %的乙醇洗涤细胞团块，真空干燥，再溶解在50μl的超纯水中。原始DNA提取物用Glassmilk purification kit (Bio101, La Jolla, CA)进一步纯化。

所需试剂：Na2HPO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，10 % SDS（十二烷基硫酸钠），Tris饱和酚，氯仿/异戊醇（体积比24:1混合），异丙醇，0.5 mol/L NaCl，70 %乙醇。

苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定

Tris平衡苯酚的配制方法 
       1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。  
       2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。 
       3. 苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下： 
          ① 液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。 
          ② 加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色。有助于方便识别有机相。 
          ③ 加入等体积的1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。  
          ④ 重复操作步骤③。 
          ⑤ 加入等体积的0.1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。  
          ⑥ 重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相。 
          ⑦ 使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。 
          ⑧ 将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存

唐琳的引物：
F357GC(5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG CCTAC GGGAG GCAGC AG-3’)
R518(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)