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1、 本科毕业论文 内蒙古乌拉特中旗传统乳制品中乳酸菌的分离鉴定 学 院：食品科学与工程 专 业：食品科学与工程 学 号：110910787 姓 名： 指导教师： 职 称： 论文提交日期：二Ο一五年六月 摘 要 传统乳制品是乳酸菌的天然栖息环境，为了认识和研究干旱半荒漠地区传统乳制品中乳酸菌菌群结构，并分离保藏该乳酸菌资源，以采自内蒙古乌拉特中旗的35份传统乳制品样品（19份酸牛奶，7份奶油，2份奶酪，7份鲜牛奶)为研究对象，运用纯培养技术和16S rRN
2、A基因序列分析方法对样品中乳酸菌进行分离鉴定。结果显示：从35份样品中共分离获得属于12个种和亚种的124株乳酸菌，即Lac. lactis subsp. lactis（48株，占分离株38.71%）、L. plantarum（32株，占25.81%）、Leu. mesenteroides（22株，占17.74%）、L. paracasei（6株，占4.84%）、L. helveticus（5株，占4.03%）、L. rhamnosus（3株，占2.42%）和L. brevis、L. diolivorans各2株（分别占1.61%），且Leu. pseudomesenteroide、E. du
3、rans、E. sulfurous、L. buchneri各1株（分别占0.81%）。其中以Lac. lactis subsp. lactis和L. plantarum为样品中优势菌群，其次Leu. mesenteroides和L. paracasei的分离数量较多。 关 键 词：传统乳制品；乳酸菌；分离鉴定 Isolation and identification of Latic acid bacteria from traditional dairy products in Wulate Zhongqi Abstract Traditional dairy
4、 products were the natural habitats of lactic acid bacteria. In order to reveal and research the population structure of lactic acid bacteria, and preserve lactic acid bacteria from traditional dairy products in arid and desert areas. Lactic acid bacteria were isolated and identified using pure cult
5、ure method and 16S rRNA gene sequencing from sixty nine samples of traditional dairy products, including yogurt, cream, cheese and milk, which were collected from pastoral of Wulate Zhongqi areas of Inner Mongolia.The results showed as follows: 124 isolates from 35 samples of Wulate Zhongqi of Inne
6、r Mongolia were identified into 12 species or subspecies, including Lac. lactis subsp. lactis (48 strains, account for 38.71% of the total isolate), L. plantarum (32 strains, account for 25.81%), Leu. mesenteroides (22 strains, account for 17.74%), L. paracasei (6 strains, account for 4.84%), L. hel
7、veticus (5 strains, account for 4.03%), L. rhamnosus (3 strains, account for 2.42%) and L. brevis, L. diolivorans (2 strains, account for 1.61% respectively) and Leu. pseudomesenteroide、E. durans、E. sulfurous、L. buchneri (1 strains, account for 0.81% respectively). Lac. lactis subsp. lactis and L. p
8、lantarum were the predominant species of samples, the second are Leu. mesenteroides and L. paracasei. Key words: Traditional dairy products; Lactic acid bacteria; Isolation identification 目 录 1 引言 1 1.1 乳酸菌概述 1 1.1.1 乳酸菌 1 1.1.2 乳酸菌的益生作用 1 1.2 乳酸菌的分类鉴定方法
9、1 1.2.1 传统鉴定方法 2 1.2.2 分子生物学方法 2 1.3 研究内容 2 2 材料与方法 3 2.1 材料 3 2.1.1 样品来源 3 2.1.2 试验试剂 3 2.1.3 仪器与设备 4 2.2 方法 5 2.2.1 样品采集 5 2.2.2 乳酸菌组成分析 5 2.2.3 乳酸菌的分离纯化及保存 5 2.2.4 16S rRNA基因序列同源性分析 6 3 结果与分析 8 3.1 传统乳制品中乳酸菌组成分析 8 3.2 传统乳制品中乳酸菌的分离结果 9 3.3 乳酸菌16S rRNA基因序列同源性鉴定结果 9
10、 3.3.1 分离株基因组DNA提取结果 9 3.3.2 乳酸菌16S rRNA 扩增的电泳结果 10 3.3.3 测序结果及系统发育树的构建 11 4 结论 13 致 谢 14 参 考 文 献 15 个 人 简 介 17 17 内蒙古农业大学学士学位论文 1 引言 1.1 乳酸菌概述 1.1.1 乳酸菌 乳酸菌是一种能够在可运用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，它的特征是：革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶呈阴性，无芽孢，很少运动或无运动性，发酵糖类产生50% 以上乳酸，低氧环境中适宜生长，分解蛋白质和脂肪能力较弱，产酸能
11、力强[1]。乳酸菌广泛分布于人体、动物、植物和整个自然界，如存在于乳制品、肉制品、蔬菜等食品，也有部分栖居于人类及其他哺乳动物的口腔和肠道等环境中，在土壤、湖泊、动物饲料中也发现了乳酸菌的存在[2,3]。 1.1.2 乳酸菌的益生作用 乳酸菌是发酵乳制品(益生菌酸奶、发酵乳饮料、干酪和发酵奶油)生产当中必不可少的菌种，其独特的生物学功能使乳酸菌在工农业、食品及医疗保健等领域中有了很高的应用价值[4]。乳酸菌发酵糖类物质产生的主要代谢产物乳酸可以使产品pH值降低，达到抑制腐败菌的目的，从而提高产品的营养价值及保藏性；此外乙醛、双乙酰等代谢产物赋予发酵乳独特的风味和质地，从而改善产品风味
12、[5]。 目前，随着人们对肠道菌群研究的不断深入，发现乳酸菌作为人体肠道中重要的生理菌群与机体健康息息相关。具有维持人体内微生态平衡、增强人的免疫功能、预防胃肠道疾病、阻止致病菌定殖、提高营养利用率、控制内毒素、延缓机体衰老、促进营养吸收、降低胆固醇水平等诸多有益于人体健康的益生作用[6]。临床应用上，乳酸菌可以作为益生菌预防和治疗腹泻，且能提高乳糖不耐者对于乳糖的消化及利用。此外，乳酸菌在过敏性反应和结肠炎性疾病的预防和治疗方面也具有重要作用[7]。 1.2 乳酸菌的分类鉴定方法 1.2.1 传统鉴定方法 传统的分类方法主要依据菌株的菌落形态特征，生理生化特性和代谢产物等表面
13、特征对乳酸菌进行鉴定[8]，通常对微生物在培养基上形成的生长状态和菌落形态进行观察，并且在显微镜底下对个体形态进行研究，观察菌体细胞形态、大小和排列方式，还通过乳酸脱氢酶试验，葡萄糖产气试验，耐酸碱生长试验等方面进行鉴定。在过去的那些年，Orla-Jensen 根据菌株的菌株生理生化特性以及菌落特形态特征等指标，能够把属于乳杆菌属内的菌种再细分为三个亚属，即Thermobacterium、Streptobacterium 和 Betabacterium[9]。传统分类法可以对乳酸菌分类鉴定，但是这种表型特征法有一定的局限性，因为仅依靠菌株的特征很难分辨生理生化特性极其相似的菌株，又不能准确的说
14、明乳酸菌菌群结构，不能表示菌株基因亲缘关系[10]。 1.2.2 分子生物学方法 近年来，现代生物科学技术的飞速发展促进了分子生物学技术在乳酸菌分类鉴定研究领域中的应用。核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)基因被人们认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，其在细菌的进化过程中相对保守，素有“细菌石”之称[11]。原核生物的三种核糖体亚基中，16S rRNA含有1540个核苷酸，其大小适中便于序列分析，同时具有高度保守性和高变性。其保守性反映生物物种间的亲缘关系，作为分析系统发育树的重要依据；高变性揭示生物物种的特征核苷酸序列，具有着株、种、属的结构特征，细菌种属鉴定
15、的分子基础[12]。因此，16S rRNA基因成为黄金标准，在细菌的分类、鉴定中被广泛的应用。 16S rRNA基因序列分析技术的基本原理是基于纯培养技术从微生物细胞中提取基因组DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物对16S rRNA基因片段进行扩增，并通过测定扩增产物，获得核苷酸序列，将其提交到GenBank数据库，采用Blast软件与已知序列进行比对，从而可以确定微生物的所属物种。16S rRNA 基因序列分析技术作为细菌分子生物学鉴定方法之一，已被广泛应用于细菌的分类、鉴定研究中。 孙天松，刘红霞[13]等对发酵酸驼乳中乳酸菌和酵母进行了分离，并采用16S rRNA基因序列分析
16、方法对分离株进行分类鉴定，从而确定为干酪乳杆菌是样品中优势菌群。赵蕊、霍贵成[14]等采用传统分类与16S RNA基因序列测定结合的方法对从新疆酸奶中分离到的乳酸菌进行了鉴定。Randa[15]用传统方法、RFLP和16S rRNA基因序列分析方法对绿橄榄中的乳酸菌进行了研究，结果发现，传统方法鉴定其中24株为干酪乳杆菌，13株为短乳杆菌，其余的11株为植物乳杆菌，而16S rRNA基因序列分析方法则表明大多数为干酪乳杆菌。Jassim[16]采用16S rRNA基因序列分析方法方法鉴定了13株分离自健康猪小肠、直肠和盲肠中的细菌，结果发现8株为瘤胃乳杆，2株为粪肠球菌。 1.3 研究
17、内容 本试验采用纯培养技术和形态学观察，对采集于内蒙古乌拉特中旗的35份传统乳制品样品（发酵酸奶、奶油、奶酪和鲜奶）进行乳酸菌分离，并运用16S rRNA基因序列分析方法对革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的乳酸菌分离株进行分类鉴定。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 样品来源 本试验所用的35份传统乳制品样品采集于内蒙古乌拉特中旗。具体的采样地点见图1。 图1传统乳制品采集地点 Fig. 1 Collecting site of traditional dairy products 注：★为采样地点 2.1
18、2 试验试剂 试验中所用试剂配制所需的药品全部都是购自大连宝生物技术有限责任公司，都是内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供，具体如表1所示。 表1 主要试剂列表 Tabel.1 Material list 试剂名称 配制或来源 MRS固体培养基(288210，美国BD公司) 无锡赛维技术有限公司 MRS液体培养基(CM0359，英国OXOID公司) 上海汉尼生物技术有限公司 M17固体培养基(CM0785B，英国OXOID公司) 上海汉尼生物技术有限公司 M17液体培养基(CM0817B，英国OXOID公司) 上海汉尼生物技术有限公司 1
19、0%脱脂乳保护剂 参考文献[17]配制 0.5M EDTA 参考文献[17]配制 10×TE缓冲液(pH 8.0) 参考文献[17]配制 10% SDS 参考文献[17]配制 10M CTAB 参考文献[17]配制 酚/氯仿/异戊醇(25：24：1，V/V) 参考文献[17]配制 5M NaCl 参考文献[17]配制 氯仿/异戊醇(24：1，V/V) 参考文献[17]配制 3M NaAc, 参考文献[17]配制 5×TBE电泳缓冲液贮液 参考文献[17]配制 dNTPs (每种2.5 mM) 大连宝生物技术有限公司 10×EasyTaq Buffe
20、r 大连宝生物技术有限公司 EasyTaq DNA polymerase (5 U/μL) 大连宝生物技术有限公司 核酸染料GELVIEW 大连宝生物技术有限公司 DL 2000 DNA Marker 大连宝生物技术有限公司 6×DNA Loading Buffer 大连宝生物技术有限公司 2.1.3 仪器与设备 表2 试验所用的主要仪器以及设备 Table.2 Main equipments used in study 仪器名称 仪器型号 仪器制造厂 垂直流超净工作台 ZHJH-1214B 上海智城分析仪器制造有限公司 电热恒温培养箱 D
21、HP- 9272 上海一恒科技有限责任公司 光学显微镜 BX50 日本奥林巴斯(OLYMPUS) 全自动高压蒸汽灭菌器 HA-300M 日本HIRAYAMA公司 游祸振荡器 Vortex-genie2 美国 Scientific Industries 公司 厌氧培养罐 AG0035A 英国OXOID公司 台式大容量高速冷冻离心机 5810R 德国Eppemlorf公司 全自动高压干热灭菌器 SP-650 日本三洋电器集团(SANYO) 真空冷冻干燥机 LL-6SFPY 美国LABCONCO公司 低速离心机 KDC-1044 安敏中科中佳科学仪器
22、有限公司 微量紫外分光光度计 ND-1000 美国NanoDrop公司 电热恒温水浴锅 HWS-28 上海一恒科技有限公司 PCR热循环仪 9902 美国Applied Bio砂stems公司 凝胶成像系统 GDS-8000 美国UVP公司 多用途水平电泳槽 BG-subMIDI 北京百晶生物技术有限公司 水平摇床 WD-9405B 北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器公司 电泳仪 DYY-12 北京市六一仪器厂 2.2 方法 2.2.1 样品采集 吸取1.5mL样品放进装有0.5g 灭菌中和剂（淀粉/CaCO3，50：1，M/M）的无菌冻存
23、管之中，混合均匀；采集固体样品时，用灭菌勺取5g左右样品装入无菌冻存管中。标记样品号，用封口膜封口，放入4℃便携式冰箱，低温储存。将样品带回实验室里，进行微生物组成分分析以及乳酸菌的分离试验。 2.2.2 乳酸菌组成分析 吸取0.5mL充分混匀的液体样品或称取0.5g固体样品，移至4.5mL 的灭菌生理盐水（0.85%，w/v）充分混匀，采用十倍梯度稀释法进行稀释，选取稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液，分别吸取1mL于无菌培养皿中，将灭完菌处于保温状态的培养基（约20mL）倒入平皿中，小心旋转平皿，混匀。待平板中培养基完全凝固后，移置厌氧培养罐中（气体条件：CO2
24、H2：N2= 10：10：80）30℃培养48～72h，用于乳酸菌计数。 2.2.3 乳酸菌的分离纯化及保存 分别从2.2.2制备的稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液中吸取200μL置于预先制备的MRS和M17固体平板培养基上，均匀涂布。之后将平皿置于厌氧培养罐中，30℃ 培养48～72h，待菌落形成后，观察菌落形态，编号，做记录。用无菌接种环挑取已标记的单个特征菌落对应接种于MRS或M17液体培养基中，30℃条件下厌氧培养24h。生长良好的一代菌株被用于革兰氏染色试验（涂片、固定、染色、脱色），并镜检后将革兰氏阳性纯培养物的菌株划线接种于MRS或M17固体培养基。镜检后
25、将细胞形态特征、排列方式不一致的菌株继续划线接种于MRS或M17固体培养基，进行纯化试验。最后将革兰氏染色试验呈阳性、过氧化氢酶试验呈阴性的无芽孢的球状、杆状和链球状的分离株暂定为乳酸菌。 暂定为乳酸菌的分离株接种于MRS或M17液体培养基中，30℃培养24h后继续再传2代。放在离心机中，3000×g，离心10min，等沉淀菌体。弃上清，加入5mL PBS缓冲液，混匀后离心收集菌体。重复2～3上述离心步骤，最后得到菌泥，涂片、染色（革兰氏染色四步骤），镜检观察细胞形态、排列方式，将未污染菌株采集图像。最后将镜检合格的洗涤收集好的菌泥中加入已灭好菌的乳酸菌保护剂，约2~2.5mL，震荡混匀后，
26、用灭菌巴氏吸针吸取适量的菌悬液，分别分装到无菌安瓿管和无菌冻存管中。安瓿管置于液氮中迅速冻结后，进行真空冷冻干燥，最后高温切割封口，在4℃冷藏保存；冻存管放在﹣80℃冻结储存。 2.2.4 16S rRNA基因序列同源性分析 2.2.4.1 分离株基因组DNA的提取 采用了液氮反复冻融-CTAB法提取乳酸菌分离菌株的基因组DNA[18]。 （1）将低温保藏的分离株接种于MRS或M17液体培养基中，30℃培养24h，再传代培养2~3次，将对数生长末期的菌体培养物，取适量放入1.5mL灭菌EP管中，3000×g离心10min，弃上清，收集菌体。 （2）吸取500μL TE缓冲液，
27、加入菌体沉淀中，震荡混匀。将EP管放在液氮中速冻5min，拿出之后迅速放入65℃的水浴之中水浴融化，即为一次冻融，这样重复冻融3次。 （3）吸取80μL的SDS（ 10% W/V）和15μL的蛋白酶K（20mg/mL），加入EP管中，置于条件为37℃、200r/min空气摇床中，震荡4~12 h。取出EP管，吸取NaCl（5mol/L）溶液100μL和CTAB（10mol/L）溶液80μL，加入EP管中，混匀后置65℃水浴30min，获取菌体粗提液。 （4）吸取等体积（约750μL）的酚/氯仿/异戊醇溶液，加入EP管中，经颠倒混匀1min，静置2min后，4℃、12000×g离心10min
28、吸取上清液置于另一EP管，加入氯仿/异戊醇溶液700μL，混匀静置2min后，4℃、12000×g离心10min。 （5）吸取上清液置于另一EP管，加入500μL预冷的异丙醇和3mol/L醋酸钠50μL，混匀后置于-20℃，静置30min。取出后12000×g、4℃离心10min，弃掉上清液，获得DNA沉淀。 （6）吸取500μL 70%的乙醇，加入DNA沉淀中，8000×g、4℃离心5min，弃上清，在空气中自然干燥。最后加入20~50μL TE溶液，室温下回溶DNA，置于-20℃保存。 2.2.4.2 分离株基因组DNA纯度的检测 使用含有浓度为0.01% 的核酸染料的0.
29、8% 琼脂糖凝胶对基因组DNA原液进行电泳检测（电压为5V/cm、电泳液为0.5×TBE），0.5h后在凝胶成像仪紫外灯下照相、观察电泳结果。基因组DNA原液的OD值和浓度采用ND-1000型微量紫外分光光度计进行检测。 2.2.4.3 16S rRNA基因序列的的扩增、测序及系统发育树的构建 1） 引物 使用于扩增乳酸菌16S rRNA基因的引物序列为： FA-27F: 5'- GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘ RA-1495R:5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3
30、‘ 试验所用引物由桑尼生物科技有限公司（上海）合成。 2） 扩增体系以及参数 把上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用50μL反应体系进行PCR扩增，如表3所示。 表3 PCR扩增体系 Table.3 The amplification system for PCR reaction 体系成分 用量 10×PCR buffer (Mg2+) 5 .0μL dNTP mix (10mmol/L) 4 .0μL 引物FA-27F (10pmol/μL) 1.5 μL 引物RA-1495R (10pmol/μL) 1.5 μL Tap DNA p
31、olymerase (5U/μL) 0.5 μL 模板DNA (100 ng/μL) 2 μL ddH2O 补充至50 μL PCR扩增循环参数如下： 94 ℃预变性 5min，94 ℃变性 1min，58 ℃退火 1min，72 ℃延伸 2min，72 ℃末端延伸 10min，4℃保温。（需30个循环） 3） PCR产物检测及测序 取5μL的PCR扩增产物与2μL的6×Loading Buffer上样缓冲液混合，使用1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳检测（电压为5V/cm、电泳液为0.5×TBE），0.5h后在凝胶成像仪紫外灯下照相、观察电泳结果。要是在1500bp处看到
32、清晰的条带，并且没有明显的非特异性扩增，就是PCR成功，把产物寄到上海美吉生物技术有限责任公司，迅速进行双向测序。 4） 16S rRNA基因序列同源性分析 运用源于DNAStar 6.1软件中SeqMan软件对所测得菌株的16S rRNA两条序列进行拼接和整理，得到1300bp~1450bp有效序列。在NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库中，利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST）搜索工具，将所拼接好
33、的序列与GenBank数据库中已存档菌株的16S rRNA基因序列作同源性比对，若同源性比较结果大于99%，则可以确定此菌株与模式菌株属于同一个菌种。 3 结果与分析 3.1 传统乳制品中乳酸菌组成分析 表4 传统乳制品中乳酸菌活菌计数结果（lg CFU/mL）( ± SD ) Table.4 LAB counts in tradional dairy products samples（lg CFU/mL）( ± SD ) 样品编号 活菌数 (lg CFU/mL) 样品编号 活菌数 (lg CFU/mL) 样品编号 活菌数 (lg CFU/mL)
34、 BM35 8.91±0.04 BM47 8.50±0.02 BM59 9.16±0.05 BM36 8.15±0.02 BM48 8.74±0.01 BM60 8.62±0.02 BM37 9.10±0.01 BM49 8.80±0.05 BM61 8.21±0.01 BM38 9.02±0.04 BM50 8.67±0.02 BM62 8.38±0.00 BM39 9.14±0.01 BM51 8.40±0.08 BM63 7.67±0.05 BM40 7.15±0.01 BM52 8.50±0.01 BM64 7.50
35、±0.05 BM41 8.43±0.02 BM53 8.91±0.06 BM65 9.07±0.06 BM42 6.74±0.09 BM54 6.93±0.02 BM66 8.36±0.02 BM43 8.49±0.05 BM55 8.74±0.02 BM67 7.84±0.18 BM44 8.76±0.01 BM56 8.19±0.04 BM68 8.06±0.01 BM45 8.84±0.06 BM57 7.60±0.04 BM69 8.20±0.02 BM46 8.42±0.06 BM58 8.51±0.05
36、注：“BM”表示乌拉特中旗 表4为内蒙古乌拉特中旗传统乳制品中乳酸菌活菌计数结果，从表可以看出，样品中乳酸菌活菌数范围在6.74~9.16 lgCFU/mL，其中有5份样品活菌数达到109CFU/mL以上，23份样品活菌数达到108CFU/mL以上，5份样品活菌数达到107CFU/mL以上，剩余2份样品活菌数相对较低，但也接近107CFU/mL。 3.2 传统乳制品中乳酸菌的分离结果 经过革兰氏染色以及过氧化氢酶试验，35份样品之中共分离出124株乳酸菌。 表5 传统乳制品中分离的乳酸菌数量统计表 Table.5 The LAB number of isolated f
37、rom tradional dairy products samples 酸牛奶(19份) 奶油(7份) 奶酪(2份) 鲜牛奶(7份) 总计 杆菌 21A+9B 6A+4B 11A 51(38A+13B) 球菌 14A+22B 10A+2B 4A+5B 6A+10B 73(34A+39B) 总计 66(35A+31B) 22(16A+6B) 9(4A+5B) 27(17A+10B) 124(72A+52B) 注：“A”表示分离自MRS 培养基；“B”表示分离自M17 培养基 从表5可知，内蒙古乌拉特中旗传统乳制品酸牛奶中分离到66株
38、分离株，奶油中分离到22株分离株，奶酪中分离到9株分离株，鲜牛奶中分离到27株分离株，共分离得到124株乳酸菌，其中73株为球菌,51株为杆菌。还可以看出采用MRS培养基分离到的杆菌数量（38株）多于M17培养基分离到的杆菌数量（13株），采用M17培养基分离到的球菌数量（39株）多于MRS培养基分离到的球菌数量（34株）。 3.3 乳酸菌16S rRNA基因序列鉴定结果 3.3.1 分离株基因组DNA的提取结果 采用了液氮冻融-CTAB法提取分离株基因组DNA，使用了微量紫外分光光度计进行检测分离株基因组DNA的浓度以及纯度，结果显示，所有分离株的基因组DNA的浓度均在于100
39、~3000ng/μL之间，纯度值（A260/A280比值）在1.8~2.0范围内。分离株基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果如下面图2所示，大约在23Kb处可见清晰、明亮的条带，且其无拖尾、弥散现象，从而可知分离株基因组DNA满足后续试验要求。 图2 部分分离菌株DNA琼脂糖凝胶电泳图 Fig.2 The agarose gel electropherogram of isolates genomic DNA of partial isolates 注：1-10 为部分离株的基因组DNA； M：λ-DNA/HindIII Markers 3.3.
40、2 乳酸菌16S rRNA 扩增的电泳结果 采用通用引物FA-27F和FR-1495R对分离株16S rRNA 基因进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，结果如图3所示，大约在1500bp位置处可见清晰、明亮的条带，且其无拖尾、无明显的非特异扩增现象，由此可知分离株16S rRNA基因PCR扩增产物满足后续测序试验要求。 图3 部分分离株16S rRNA基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 3 The agarose gel electrophoresis of PCR amplification of pa
41、rtial isolates 16S rRNA gene 注：1-24：部分分离株16S rRNA基因的 PCR 产物； M：DL 2000 DNA Markers 3.3.3 测序结果及系统发育树的构建 1） 测序结果 将124株待测菌的扩增产物送到上海美吉生物科技有限责任公司测序完毕，已经上传到NCBI上。可以通过上传序列号直接在网上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取该菌的序列。 2） 系统发育树构建 IMAU11616(KP763919) Lactobacillus plantarum ATCC14917(AJ
42、965482) IMAU11615(KP763876) Lactobacillus brevis ATCC14869(M58810) IMAU11599(KP763877) Lactobacillus buchneri ATCC4005(AB205055) IMAU11562(KP763951) Lactobacillus diolivorans DSM14421(AF264701) IMAU11531(KP763947) Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(D16552) IMAU11601(KP763901) Lactobac
43、illus paracasei ATCC25302(D79212) IMAU11594（KP763890） Lactobacillus helveticus DSM20075(AM113779) IMAU11505(KP763971) ) Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC19435(AB100803) IMAU11540(KP764026) Leuconostoc mesenteroides NCFB529(AB023244) IMAU11575(KP764062) Leuconostoc pseudomesenteroide
44、 ATCC12291(AB023237) IMAU11556(KP763871) Enterococcus durans ATCC19432(AJ276354) IMAU11565(KP763875) Enterococcus sulfureus ATCC49903(AF061001) Bacillus.subtilis NCDO1769T(X60646) 100 100 100 99 100 100 99 100 97 65 100 84 99 100 76 93 95 75 98 98 49 0.01
45、 图4 部分乳酸菌分离株的16S rRNA基因序列的系统发育树 Fig.4 Phylogenetic analysis of 16S rRNA sequences of LAB isolates of type strains 由待测124株乳酸菌的16S rRNA基因序列与参考菌株的16S rRNA基因序列利用软件中的cluster W构建系统发育树（如图4），菌株IMAU11615的16S rRNA基因序列与模式菌株L. brevis ATCC14869的同源性达到99%以上，所以把它鉴定为
46、L. brevis。菌株IMAU11616与模式菌株L. plantarum ATCC14917聚为一类，且同源性为99%以上，故将其归为L. plantarum。菌株IMAU11599 与模式菌株L. buchneri ATCC4005聚为一类，且同源性达到99%以上，故将其鉴定为L. buchneri。菌株 IMAU11562与模式菌株L. diolivorans DSM14421同源性达到99%以上，故将其归为L. diolivorans。菌株IMAU11531与模式菌株L. rhamnosus ATCC7469的同源性达到99%以上，故将其鉴定为L. rhamnosus。菌株IMAU1
47、1602与模式菌株L. paracasei ATCC25302的亲缘关系最近，且同源性达到99%以上，故将其归为L. paracasei。菌株IMAU11594与模式菌株L. helveticus DSM20075聚为一类，且其同源性为99%以上，故将其鉴定为L. helveticus。菌株IMAU11540的16S rRNA基因序列与模式菌株Leu. mesenteroides NCFB529的同源性达99%以上，故将其鉴定为Leu. mesenteroides。菌株IMAU11575与Leuconostoc属的模式菌株Leu. pseudomesenteroide ATCC12291亲缘关
48、系最近，且同源性为99%以上，所以将其归为Leu. pseudomesenteroide。菌株 IMAU11505与模式菌株Lac. lactis subsp. lactis ATCC19435同源性达到99%以上，故将其归为Lac. lactis subsp. lactis。菌株IMAU11565与模式菌株E. sulfurous ATCC49903的同源性达到99%以上，故将其鉴定为E. sulfurous。菌株IMAU11556与模式菌株E. durans ATCC19432聚为一类，且其同源性为99%以上，故将其鉴定为E. durans。 由表6可知，分离自内蒙古乌拉特中旗35份样品
49、中的124株乳酸菌分别属于12个种和亚种，即Lac. lactis subsp. lactis（48株，占分离株38.71%）、L. plantarum（32株，占25.81%）、Leu. mesenteroides（22株，占17.74%）、L. paracasei（6株，占4.84%）、L. helveticus（5株，占4.03%）、L. rhamnosus（3株，占2.42%）和L. brevis、L. diolivorans各2株（分别占1.61%），且Leu. pseudomesenteroide、E. durans、E. sulfurous、L. buchneri各1株（分别占0
50、81%）。其中Lac. lactis subsp. lactis和L. plantarum为样品中优势菌群，其次Leu. mesenteroides和L. paracasei的分离数量较多。 表6 内蒙古乌拉特中旗传统乳制品中乳酸菌种类的分布 Table.6 Distribution of lactic acid bacteria in tradional dairy products samples 乳酸菌种属 样品 分离株数 量 (株) 酸牛奶 (19份) 奶油 (7份) 奶酪 (2份) 鲜牛奶 (7份) L.
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