毕业论文-棉团铁线莲小孢子发生与雄配-子体形成.doc

延边大学本科论文

学校代码： 10184
学 号： 2084120410

延 边 大 学
本 科 毕 业 论 文

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题 目：棉团铁线莲小孢子发生与雄配子体形成
学生姓名：张贺
学 院：延边大学农学院
专 业：园林专业
班 级：2008级
指导教师：全雪丽 副教授

二 〇 一 二 年 六 月

摘 要

棉团铁线莲（Clematis hexapetala）是毛茛科（Ranunculaceae）铁线莲属（Clematis）多年生草本植物。通过文献调查发现，国内关于棉团铁线莲的研究报道极少，其研究主要集中在化学成分研究方面，但尚未涉及到小孢子发生与雄配子体发生问题。为了能将棉团铁线莲尽早开发利用，采用石蜡切片技术，观察棉团铁线莲小孢子发生和雄配子体的形成过程，揭示棉团铁线莲的胚胎学特征，为毛茛科铁线莲属胚胎学研究积累资料，而且对开展花药离体培养、杂交育种均有重要意义。研究结果表明：棉团铁线莲每个花药横切面呈蝶形，具四个花粉囊；小孢子在四分体中的排列以四分体型为主；成熟花粉粒近球形，属2-细胞花粉粒，花粉粒表面有3条萌发沟；花粉囊壁由4层细胞构成，即表皮（1层）、药室内壁（1层）中层（数层）、绒毡层（1层）；绒毡层发育属分泌型。
关键词：棉团铁线莲；小孢子；雄配子体

Abstract

Clematis hexapetala, which belongs to Ranunculaceae Clematis is a kind of perennial herbs.According to the document investigation .Through the literature survey found that domestic reports of research on Clematis hexapetsla pall Chinese bulbul few, its research mainly focus on chemical composition research, but not yet involve microspore occurrence and male gametophyte problems. In order to bring Clematis hexapetsla pall early development and utilization, so Chinese bulbul study uses conventional paraffin technology, its microspore occurrence and male gametophyte development process of Chinese bulbul, revealing Clematis hexapetsla pall characteristic, embryology for the buttercup family, Clematis hexapetsla pall genera embryology research to develop, and accumulated data anther in vitro culture, hybrid breeding are to have the important meaning. The results of the study indicate that:The results indicated that the crose-section of anther was butterfly-shaped,each anther included four pollen sacs;microspore were tetrahedron-shaped;mature pollens were subglobose,two-cell type, with three germinal furrows;wall of pollen sac was consisted by four layers, epidermis（one layer）,endothecium（one layer）,middle layer（several layers） and tapetum（one layer）；tapeta were secretor type.
Key words：Clematis hexapetsla pall；microspore；male gametophyte

目 录
引 言 1
第一章 材料与方法 3
1.1材料 3
1.2方法 3
第二章 结果与分析 4
2.1 花药壁的发育 4
2.2小孢子发生与雄配子体形成 4
22.1 小孢子发生 4
2.2.2 雄配子体形成 4
结论与讨论 7
参考文献 8
谢 辞 10

引 言

棉团铁线莲（Clematis hexapetala pall.），别名山蓼、棉花花、威灵仙，是毛茛科（Ranunculaceae）铁线莲属（Clematis）多年生草本植物，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、陕西、甘肃东部、山东。韩国、蒙古、俄罗斯东部地区也有分布。主要生于草地、林缘、沟谷、山坡林边或灌木丛中[1-2]。
棉团铁线莲是一种直立多年生草本植物，高约30-70厘米。茎上部疏披短柔毛或近无毛，具纵纹。叶绿色、近革质，对生。单叶至复叶，一至二回奇数羽状复叶。花为聚伞花序，顶生或腋生，白色，雄蕊多数，无毛，花药黄色，条形，药室侧向开裂；子房多毛。果实为瘦果，多数，扁平，先端宿存花柱，羽毛状，长约2.2厘米。花期6～8月，果期7～10月 [1-2] 。
棉团铁线莲以根和根茎入药，为《中国药典》（2005版）收载的3种正品（威灵仙C.chinensis、棉团铁线莲（C.hexapetala）、东北铁线莲C.manshurica）威灵仙药材之一。具有祛风除湿、通经活络、止痛、抗癌等功效[3-4]。临床上主要用于治疗风湿痹痛、屈伸不利、四肢麻木、跌打损伤以及胃癌、食管癌、体表良性肿瘤等，配合用药，可以减轻癌症患者放、化疗的不良反应。在农业上，对马铃薯疫病和红蜘蛛有良好防治作用；近年研究还发现，本品的根煎剂或浸剂可使麻醉狗的血压下降。对离体蟾蜍心脏有先抑制后兴奋的作用。根煎剂对小鼠、大鼠及家兔的离体肠管有明显的兴奋作用。棉团铁线莲能降低机体细胞免疫反应能力[5-8]。
魏文东等人对黄花棉团铁线莲种子通过春化处理、药剂处理及不同温度处理进行了发芽试验，结果表明4 ℃低温条件下春化处理14 d，种子发芽率最高；在不同温度条件下，种子适宜萌发温度为2O℃ ；使用50 mg／L浓度的IAA处理对种子萌发有促进作用[9]。管开云等研究表明，春化处理的种子比未春化处理的种子发芽率高[10]。扦插是铁线莲属植物的主要繁殖方法。插条种类、不同种类和浓度的生根剂处理及扦插基质等对扦插生根率均有影响。李宗艳等选用发育饱满、无病虫害的转子莲(毛茛科铁线莲属植物)枝条为插穗的研究表明，用0．637 mmol／L的IAA浸泡2～3 min或2．548 mmol／L的IAA速蘸对其生根有明显促进作用[11] 。张启香等以铁线莲半木质化的健壮枝条为插穗，用不同种类、不同浓度的外源激素进行的扦插生根试验表明，在同一浓度100 mg／kg的NAA、IBA和GGR一13种激素中以IBA的生根效果为最佳，生根率及移栽成活率分别达100%和75.5%；在不同浓度50、100、200、400mg／kg的IBA处理中，以浓度为100 mg／kg的生根效果为优，生根率及移栽成活率分别达100％和72.3% ，但随着浓度的升高，生根率逐渐下降[12]。刘冰等人采用不同基质、不同药剂对灰叶铁线莲(c.anescens)嫩枝扦插生根的影响进行了研究，认为扦插基质采用草炭土：珍珠岩=1：1和用200 mg／L NAA +200mg／L IBA处理插条能提高铁线莲的生根率，根质好，根系分布均匀，而且经济实惠[13] 。
在铁线莲组织培养方面，相关研究者以叶或茎尖作外植体在转子莲的组培研究中发现，诱导愈伤组织的配方以MS+6-BA 2．0 mg／L+2，4-D 1．0 mg／L或MS+6-BA 2．0mg／L+IBA 1．0 mg／L为好；继代增殖培养以MS+6-BA 2．0mg／L+NAA 0．5 mg／L的配方较好；生根培养基配方以1／2Ms+IAA 0．8 mg／L为好[11]。
通过大量的文献调查结果，国内外关于棉团铁线莲的研究报道极少。目前为止，关于棉团铁线莲研究主要集中在药理、化学成分分析等方面[14-16] ，该种的小孢子发生与雄配子体发生还未见报道。本文对棉团铁线莲的小孢子发生和雄配子体发育过程进行观察研究，揭示毛茛科铁线莲属植物的胚胎学特征，为进一步开展胚胎学及生殖生物学研究提供依据。

第一章 材料与方法

1.1材料
取自吉林省龙井琵岩山上野生的棉团铁线莲。
1.2方法
采用常规的石蜡切片法 [17]
（1）将棉团铁线莲不同大小花蕾经酒精脱水（将保存的材料由75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇，到无水乙醇逐级脱水，每次间隔2小时）；
（2）二甲苯透明（将材料由1/3二甲苯、1/2二甲苯、2/3二甲苯、纯二甲苯，逐级透明，每次间隔2小时）；
（3）浸蜡（在二甲苯组织块中加碎蜡（40℃）过夜，后经50%石蜡、75%石蜡、纯石蜡3次，逐级浸蜡，每次间隔2小时）；
（4）包埋（将有材料的石蜡迅速倒入包埋盒中，再将处理材料移入其中，按要求摆正位置，然后将包埋盒放入冷水中加速冷却。待石蜡完全冷却后从冷水中取出即可）；
（5）蜡块的修整与粘附（将包埋盒中的蜡块按其材料的数量分割成单个材料的蜡块，并根据其切面将蜡块修成方形然后将蜡块附于枕木上）；
（6）切片（将粘附蜡块的枕木固定在切片上，然后将磨好的锋利的切片刀装在切片机的夹刀部上，厚度调整为15μm，用旋转切片机进行切片。）；
（7）粘片、展片（用手蘸取少许蛋清甘油，均匀地涂上一薄层于载玻片上，以看不见为宜，选取切好的蜡片置于载玻片上，在温台上展片）；
（8）脱蜡、透明（二甲苯脱蜡缸中脱蜡和透明）；
（9）染色（采用番红固绿双重染色法：无水乙醇→95%乙醇→蒸馏水→苯胺番红→95%酒精去浮色→苯胺固绿→95%乙醇→无水乙醇→1/2二甲苯→纯二甲苯）；
（10）封片（光学中性树脂胶封片，进行干燥）；
（11）显微镜下观察、并进行显微照相。

第二章 结果与分析

2.1 花药壁的发育
棉团铁线莲属于两性花，每朵花具有数枚雌蕊（图1），每个雄蕊由花药与花丝组成，每一花药具有4个花粉囊，成熟花药横切面呈蝴蝶结形状（图1）。初期，花药壁的表皮、药室内壁、中层细胞都是扁平状（图2）。分化完全的花药壁自外向内由表皮层1层、药室内壁1层、中层1层至数层、绒毡层1层，共4部分构成（图3）。小孢子母细胞进入减数分裂时，绒毡层细胞体积达到最大值，并出现多核化（图3和图4）。第一次减数分裂时绒毡层细胞已出现解体现象（图4）绒毡层发育属于分泌型[18]。之后的过程中绒毡层和中层细胞都慢慢解体（图5-图10）。单核时期药室内壁细胞迅速变宽，呈径向伸长，后期在细胞壁上有明显的纤维加厚迹象（图8和图9）。
2.2小孢子发生与雄配子体形成
2.2.1 小孢子发生
在花粉囊壁发育的同时，花粉囊内的初生造孢细胞也进行分裂，花粉母细胞由造孢细胞经几次分裂形成的，其形态与周围的药壁细胞在细胞核的体积上显著不同，刚形成的花粉母细胞群呈圆形分布，它们排列紧密，细胞体积大，多角形，细胞核大，细胞质浓，核仁明显，染色质分散，无明显液泡（图2和图3）。花粉母细胞最初细胞排列紧密，随着进入减数分裂其排列变得疏松（图3），在花粉母细胞第1次减数分裂后没有形成细胞壁（图4）因此，双核细胞没有二分体时期，在第2次分裂中，两个核同时进行分裂，分裂完成时，在4个核之间产生壁，同时分隔成4个细胞（图5），其胞质分裂属同时型[19]，花粉母细胞进行减数分裂后形成的4个小孢子，被一层厚的胼胝质包围成四分体，主要以四面体型为主，还有少数的左右对称型（图5）。
2.2.2 雄配子体形成
一般情况下小孢子之间被胼胝质壁所分隔，减数分裂后由于胼胝质壁的溶解，多个小孢子彼此分开，释放到药室中（图6）。这时小孢子细胞的体积很小，形状不规则。后期细胞体积逐渐增大，变成大圆形（6-10）。单核中央期（小孢子刚形成后不久）典型的花粉壁和萌发沟（3个）已形成（图7）。随着小孢子的进一步发育，细胞核偏向一侧，再经不均等的有丝分裂，形成大小悬殊的两个细胞即营养细胞和生殖细胞（图8和图10），营养细胞体积较大，生殖细胞体积较小。刚形成的生殖细胞呈凸透镜状，紧贴花粉壁。随着花粉发育过程的进行，生殖细胞逐渐脱离花粉内壁。当生殖细胞开始游离在营养细胞的细胞质中时，生殖细胞变为球形，为2细胞花粉粒型（图8）。成熟时的二细胞花粉，生殖细胞又变成弯月形（图10）。

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图版说明

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图1: 1朵花内数枚雄蕊的花药横切片，花药4室（×100）图2：幼嫩花药横切片（×400）图3：花粉母细胞时期（×400）图4：花粉母细胞第1次分裂（×400）图5：四分体时期，示四面体型与左右对称型（×400）图6：刚刚从四分体分离的小孢子（×400）图7：核初期，萌发沟已出现（×400）图8：双核初期，纤维加厚（×400）图9：3条萌发沟，纤维加厚（×400）图10：成熟花粉粒，示2-细胞型花粉粒（×400）。

结论与讨论

棉团铁线莲胚胎学主要特征表现为：棉团铁线莲一朵花内包含多数雄蕊，每一雄蕊的花药具有4个花粉囊，最后囊开裂，散粉。花药发育过程中花粉母细胞呈圆形排列，减数分裂过程中胞质分裂属同时型，小孢子四分体属四面体型，绒毡层属分泌型，花粉粒属2-细胞花粉粒，花粉粒表面有3条萌发沟。花药壁由表皮、药室内壁、中层和绒毡层4部分组成。
棉团铁线莲每朵花内的数枚雄蕊发育时期是不同步的，外围雄蕊先成熟，内部雄蕊后成熟，即由外轮向内轮逐渐成熟。这与毛茛科植物毛茛特征是相似的，而与毛茛科植物尖萼耧斗菜特征是正相反的，尖萼耧斗菜的雄蕊是内轮向外轮逐渐成熟[20]。这说明虽然是属于一个科，但不同属之间雄蕊发育特征存在差异。
棉团铁线莲成熟花粉中生殖细胞和营养核紧密相连，构成“雄性生殖单位”（MGU）。在过去研究的许多植物的成熟花粉或花粉管中都有雄性生殖单位存在[21-22]。孔兰静等研究表明，用光镜观察显示营养核和生殖细胞很贴近，可以推断它们构成了雄性生殖单位[23]。“雄性生殖单位”这个概念是由Dumas等在研究油菜的两精子与营养核特殊关系时提出的。认为两个精细胞和一个营养核在发育过程中作为一个单独的遗传单位存在。近年来，这个概念被推广到二细胞花粉植物中[24]。胡适宜等认为形成雄性生殖单位是被子植物雄配子发育过程中的一个普遍特性。需要说明的是，有些植物在花粉粒中并不形成联合体，而是后来花粉粒萌发后，在花粉管中形成的。雄性生殖单位的最主要的特征是有利于它们随花粉管的生长同步移动到管的末端及同时被释放至胚囊中[24]。

参考文献

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谢 辞

时光如梭，转眼之间，又到了离别的季节，春梦秋云，聚散真容易。四年的时间就这样过去了，来不及感叹，大学生活已近尾声，即将向大学生活告别，想想大学四年的点滴历历在目。四年之间，校园发生了太多改变，我也在不断地成长，眼看着离校日期已日趋临近，毕业论文的完成也随之进入了尾声。四年多的努力与付出，随着本次论文的完成，将要划下完美的句号，但在这一过程当中，有太多的事值得我铭记，有太多的人我必须感谢。
本论文是在导师全雪丽教授的精心指导下完成的。感谢导师在论文的选题、实验方案的确定、实验的进行以及最后的论文撰写整个过程中给予我细心的指引和教导，使我对植物的胚胎学有了初步的了解，并最终完成毕业论文。同时我还要感谢在我学习期间给我极大关心和支持的各位老师以及关心我的同学和朋友。你们给予我的珍贵友谊，是我一生宝贵的财富。
写作毕业论文是一次再系统学习的过程，毕业论文的完成，同样也意味着新的学习生活的开始。我将铭记我曾是一名延大学子，在今后的工作中把“求真、至善、融合”的优良传统发扬光大。
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