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《酶工程实验》教案

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15

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徐 州 工 程 学 院 教 案
2013 年至 2014 年 第 1 学期 第 周 星期

课题名称（含教材章节）： 《酶工程实验》
实验一 产纤维素酶菌株筛选和产酶条件优化分析
教学目的和要求： 1、熟悉功能性菌株筛选方法
2、掌握纤维素降解菌株的筛选方法
3、掌握菌株产酶条件优化方法

教学重点： 酶工程研究开发的策略

教学难点： 产酶条件优化方法
教 学 内 容 （ 要 点 ）
1、产纤维素酶菌株的筛选分析

2、菌株产酶条件优化

徐 州 工 程 学 院 教 案 纸
一、实验目的
1、熟悉功能性菌株筛选方法
2、掌握纤维素降解菌株的筛选方法
3、掌握菌株产酶条件优化方法
二、实验原理
(一）、功能性菌株开发策略
1、应用微生物来开发酶的优点
（1）微生物生长繁殖快，生活周期短.因此，用微生物来生产酶产品，生产能力(发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。
(2）微生物种类繁多,它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。
（3)为微生物酶品种的多样性提供了物质基础.
(4）当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞获得.
因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种,通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。
2、微生物酶开发的一般程序
（一) 样品的采集
采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。
（二) 菌种的分离
培养基的确定、培养条件的确定。
（三) 菌种的初筛
（1)用简单的定性反应进行初筛；
(2）在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖,尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。
（四) 菌种的复筛
初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上,筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。
酶活的测定方法的建立尤其重要。
（五） 对复筛获得菌株的要求
（1)不是致病菌;
(2）菌株不易变易和退化；
(3）不易感染噬菌体;
(4）微生物产酶量高;
（5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；
（6)产生的酶便于分离和提取，得率高；
(7)微生物培养营养要求低。
（六） 最佳产酶条件的初步确定
(1）培养方式的确定；
（2）最佳培养条件组合；
（3)微生物产酶的特性（胞内酶、胞外酶)；
（4)微生物酶收集的时间顺序；
七) 微生物产酶性能的进一步提高
（1)获得高产菌种的突变体;
(2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；
（3）运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达;
(八） 微生物酶的提取方法
(1)酶的粗提;
（2）酶的精制。
(九) 微生物产酶菌种的保藏
（1）斜面；
（2）沙土管；
(3)冷冻.
普通冷冻保藏技术(—20℃)
超低温冷冻保藏技术（—60一—80℃）
液氮冷冻保藏技术

(二)、纤维素酶研究情况
2.1 纤维素酶简介
2。1.1 纤维素
纤维素占植物干重的35％~50％，是地球上分布最广的碳水化合物。它无色、无味，呈白色丝状,不溶于水及一般的有机溶剂。纤维素分子是由葡萄糖苷通过β—1,4糖苷键连接起来的链状高分子,分子量50000～2500000，相当于300～15000个葡萄糖基，不形成螺旋构象,没有分支结构，易形成晶体。
2.1.2 纤维素酶
纤维素酶是能将纤维素水解成还原糖的一类酶系的总称。目前普遍认为要完全降解纤维素，至少需要3种功能不同的酶协同作用。它们是 EG（内切葡聚糖酶)CBH(外切葡聚糖酶)和 CB（β—葡萄糖苷酶).
2.2 纤维素酶的应用
2。2.1 在能源方面的应用
乙醇是一种可以通过糖发酵获得的可再生能源。在美国，乙醇已经被广泛地作为石油燃料的替代品.从上世纪80年代开始，用玉米生产的燃料乙醇就被作为酒精-汽油混合燃料或者氧化燃料来使用。这些混合燃料中乙醇的体积比例高达10%。使用乙醇混合燃料可以降低石油燃料的使用量，从而在一定程度上减少了温室气体的排放。然而使用玉米生产的乙醇燃料比石油燃料成本高，因为作为一种作物,玉米需要一定的培植时间和成本；同时，玉米本身是一种食物和饲料，大量地用于生产乙醇是不可行的，毕竟耕地资源有限.废弃纤维素原料比如农林废弃物、草、锯末和木片等是生产乙醇的潜在的而充足的可再生性资源.利用纤维素酶有效地将这些纤维素物质转化成葡萄糖等单糖，然后通过微生物发酵的方法将葡萄糖转化成乙醇，将为乙醇混合燃料的生产与应用打开一片新天地。
开发利用这一可再生资源的关键是纤维素物质的预处理以和如何使纤维素酶在水解过程中酶活性最大地发挥。预处理可以去除木质素和半纤维素,在一定程度上降低纤维素的结晶度并且增加纤维素物质的可接触面积。至于纤维素酶，为了满足竞争的需要，生产每加仑乙醇的纤维素酶的成本不能过高。这样就要求尽量降低纤维素酶系统的复杂度，只保留少量几种必须组分;更重要的是生产出能够更有效地水解预处理过的纤维素物质的重组型纤维素酶.
2.2.2 在其他方面的应用
纤维素酶已被广泛的应用于食品、酿造、农业、纺织、洗衣等多个领域中.
食品工业中利用纤维素酶处理植物性原料，可使植物细胞壁软化、崩溃,从而改变细胞壁的通透性，提高细胞内含物如蛋白质、糖等的释放与提取，便于加工.另外，在过去果实和蔬菜的加工过程中，软化植物组织的办法主要采用热烫或者酸碱处理，使得果蔬的香味和维生素大量损失,使产品的食用和营养价值下降。现在利用纤维素酶进行预处理就可以避免这些缺点。
酱油酿造主要利用蛋白酶、淀粉酶等酶类对原料进行酶解，若再使用纤维素酶， 使大豆等原料的细胞膜膨胀软化破坏, 使包藏在细胞中的蛋白质、碳水化合物释放, 这样就可以缩短酿造的时间、提高产率， 同时还提高品质， 使氨基酸还原糖含量增加。
在啤酒、葡萄酒的酿造过程中也使用到纤维素酶。在低质量大麦发芽的过程中加入纤维素酶可水解β-1,3和β-1，4葡聚糖从而帮助大麦发芽。纤维素酶还可以提高啤酒的过滤效率，并能增加葡萄酒的香味.
由于畜禽饲料中含有大量的纤维素,除某些反刍动物有分解纤维素的能力外，大部分畜禽没有此能力.纤维素酶能够分解复杂的纤维素，生成易消化物质葡萄糖，便于动物吸收。在饲料中添加了纤维素酶后,其提高家畜家禽生长性能、生产性能等效果显著。
纤维素酶已成为纺织和洗衣行业的第三大酶系。生物打磨和生物抛光是目前纤维素酶在纺织行业中的主要应用纤维素酶也被用于家用洗涤剂中，因为它们可以增加去污能力，从织物表面去处小的碎纤维，增加织物表面的亮度和光泽。
2.2.3 纤维素酶应用中存在的问题
纤维素酶作为能够有效降解纤维素的酶类,无论在动物生产还是环境保护中都确实起到了一定的作用，有非常好的应用前景。但是纤维素酶在大规模工业化生产应用中很大程度上受到其活性和成本的限制.目前，对于纤维素酶的研究也仍然存在菌株产酶效率低、生产成本高、作用于动物的机理尚未完全清楚等问题,这些问题严重制约着纤维素酶的推广应用。
纤维素酶的基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制，以及了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素分解菌开辟了新的途径。国内外已开展了大量的相关研究，随着研究领域不断扩大，也取得了一定的新进展。随着生物技术的发展和酶应用技术研究的深入，纤维素酶一定会在各类大规模工业化生产中大放异彩.
2.3 产纤维素酶菌株的研究进展
自然界中存在着诸多天然的产纤维素酶的菌株,所以对产纤维素酶菌株的选育也是研究纤维素酶的一个热点。产纤维素酶的菌株主要可以分为以下几类:
1） 真菌类：
丝状真菌是目前研究最多的纤维素降解类群，该类微生物能产生大量的纤维素酶，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。其中尤以木霉属的产量居上，里氏木霉（Trichoderma ressiei）、康氏木霉(Trichoderma koniggii）、拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoniggii）、绿色木霉（Trichoderma viride)、黑曲霉(Aspergillus niger)等是其中活性较高的代表菌种。
2) 细菌类：
产纤维素酶的细菌类，目前研究较多的是纤维粘菌属、生孢纤维粘菌属、纤维杆菌和芽孢杆菌属，代表菌种有热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜酸纤维分解菌（Acidathermus Celluloluticus）、Cellulomonas fimi、Pseud-omonasfluorescens subsp、Thermomonospra fusca等。细菌产生纤维素酶的量较少，主要是内切葡聚糖酶，一般不分泌到胞外，而是处于细胞壁“固定化”的状态，可在细胞壁上形成一种突起物。
3) 其他类:
放线菌中产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌（Actinomycesmelanocyclus）、玫瑰色放线菌（Actinomyces rose odiastaticu)和纤维放线菌（Actinomycescellulos）等，分枝杆菌和原放线菌几乎不产纤维索酶或产量极低。酵母虽然很少产纤维索酶，但可以利用酵母表达系统表达纤维索酶基因，其产物高度糖基化,经正确加工修饰后直接接分泌到培养基，表达水平高，并具有正常的生物学活性。也有利用E。coli表达系统表达纤维索酶基因,但是纤维索酶在E. coli 中的表达分泌水平很低，而且提取有很大困难，所以目前应用较少.
瘤胃微生物的遗传改造也已引起了人们的广泛注意，利用DNA重组技术提高反刍动物瘤胃中纤维素转化率，可以大幅度降低饲料用量，带来巨大的经济效益。近几年来，瘤胃微生物遗传改造的研究已取得较大进展。瘤胃细菌,如Butyricibrio fibrisolcens的载、受体系统已基本建立；来自Bacteroides Succinogenes和Butyrivibrio sp的某些纤维素酶基因已相继被克隆，目前存在的主要问题是瘤胃中微生物种类繁多，各类微生物生长速度随环境不同而变化，在瘤胃中滞留时间短，难以建立起稳定的工程菌。

（三）、本实验总体步骤
1、产纤维素酶菌株的筛选分析
要求：（1)熟悉功能性菌株筛选步骤。
（2)掌握产纤维素酶菌株的筛选方法
2、菌株产酶条件优化
要求:（1)掌握葡萄糖内切酶活性分析方法.
（2）掌握产酶条件优化方法。

三、实验材料
酵母粉、蛋白胨、琼脂，羧甲基纤维素，葡萄糖，Na2HPO4，NaH2PO4,大肠杆菌，冰，1ml、2ml、5ml塑料离心管，烧杯，移液器，超声波破碎仪。

四、实验步骤
(一）、培养基的配置
1、1 LLB（Luria—Bertani）液体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g每L LB固体培养基还需加琼脂粉12 g。
2、1 L产纤维素酶菌株筛选培养基：羧甲基纤维素10 g，蛋白胨10 g,酵母粉10 g，KH2PO4 1 g, NaCl 5 g，葡萄糖2 g，琼脂12 g，灭菌备用。

（二）、高压灭菌
1、首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜；
2、放回内层锅，并装入待灭菌物品，注意不要装得太紧,以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞；
3、加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内,再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺丝，使螺丝松紧一致,勿使漏气;
4、插上电源,加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力到所需时间，本实验用0.1 MPa，121。5℃，20分钟灭菌,灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内冷空气必须完全排尽后,才能关上排气阀,维持所需压力；
5、灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内的温度自然下降,当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓,打开盖子，取出灭菌物品；
6、将取出的灭菌培养基放入37℃温度培养箱中培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
（三）、产纤维素酶菌株的筛选

将菌株转接到产纤维素酶菌株筛选培养基，在温箱中培养2-4d，然后将0.5%的刚果红倒入培养基中染色5min，倒掉刚果红后，使用5%的NaCl溶液浸泡脱色1h。若菌株周围有透明水解圈出现，则说明该菌株产纤维素酶.纤维素酶可以将培养基中的羧甲基纤维素水解为小分子量的低聚糖、二糖或单糖，刚果红与羧甲基纤维素结合后显红色，而与小分子量糖类结合不显红色,因此产纤维素酶菌株周围出现透明水解圈。对初筛到的菌株进行划单菌落复筛.改变温度对产纤维素酶菌株进行培养，测量透明水解圈与菌落直径的比值初步确定产纤维素酶活性高的菌株。

（四）、菌株保藏
将菌种悬浮在甘油蒸馏水中,置于低温下保藏，本法较简便,但需置备低温冰箱.保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。本实验中采用的-79℃进行保藏菌种.
取菌种保藏管,标上号，倒入50%的甘油（121℃蒸汽灭菌20min)和50%的菌液（对号）,上下颠倒，混匀,放入-79℃冰箱中。

五、作业
1、将筛选菌株结果照片粘贴上，并分析筛选结果。
2、总结产纤维素酶菌株筛选的注意事项。

徐 州 工 程 学 院 教 案
2013 年至 2014 年 第 1 学期 第 周 星期

课题名称（含教材章节）: 《酶工程实验》
实验二 产酶菌株酶基因克隆分析
教学目的和要求： 1、掌握根据保守性序列设计引物方法。
2、使用PCR方法扩增相关酶基因，测序，分析序列特征。

教学重点： 酶基因克隆的策略

教学难点： 序列分析软件的使用方法
教 学 内 容 （ 要 点 ）
1、纤维素酶基因引物设计和克隆

2、纤维素酶基因序列分析

徐 州 工 程 学 院 教 案 纸
一、实验目的
1、掌握根据保守性序列设计引物方法。
2、使用PCR方法扩增相关酶基因，测序，分析序列特征。
3、掌握分子酶工程的基本技术。
二、实验原理
通过人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能。新型酶开发的一个重要方法是克隆新的酶基因,通过重组表达，获得功能性酶蛋白，并加以改造和工业化应用。
本实验根据保守性序列设计引物，通过PCR方法,扩增获得纤维素酶基因，以琼脂糖凝胶电泳技术，分析扩增结果，送生物公司进行测序，再利用生物信息学软件分析酶的序列特征。
三、实验材料
PCR引物、硼酸、琼脂糖，羧甲基纤维素，葡萄糖,Na2HPO4,NaH2PO4，大肠杆菌，冰,1ml、2ml、5ml塑料离心管，烧杯，水平电泳仪,凝胶成像观察仪、微量移液器。

四、实验步骤
(一)、菌株基因组DNA的提取
提取各菌株基因组DNA，作为 PCR反应模板［27］

1、按1％的接种量接种细菌到装有5 ml LB培养基的试管中，30℃150r/m振荡培养过夜,使其长至对数期。次日取1 ml菌液于1.5 ml离心管，10，000×g离心1min沉淀菌液。
2、弃上清，加1 ml0.9％NaCl将沉淀重悬浮，10，000×g离心3min.
3、弃上清，加450微升水，重悬浮，加50微升20％SDS，轻轻多次吹打，并上下颠倒离心管，使沉淀混匀，75℃水浴5min（直至菌液裂解为澄清)。
4、加500微升3：1的酚比氯仿抽提蛋白质，轻轻（防止破坏DNA链)上下颠倒使之混匀，10,000×g离心5 min。
5、轻轻吸取上清于一新的1。5 ml离心管（注意不要吸到中间的蛋白质）并补足体积到500微升，加500微升3:1的酚比氯仿，10,000×g离心5 min。吸上清，如此反复，直至看不到中间的蛋白质为止（注意尽量防止DNA在抽提中发生断链讲解）。
6、吸取上清于一新的1。5 ml离心管并补足体积到500微升，加500微升氯仿，轻轻混匀，10，000×g离心5 min。
7、吸取上清于一新的1.5 ml离心管，补充到500微升，加十分之一体积3 M NaAc，然后加等体积的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到有絮状沉淀产生，10，000×g离心5 min。
8、将上清吸出，加1 ml 70%的乙醇清洗沉淀，10，000×g离心5min,去上清,室温干燥。
9、加50微升TE缓冲液溶解沉淀，取2微升电泳检测DNA质量及浓度.或用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，使用0。5％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

（二)、引物的设计
根据序列保守性设计合成引物。

（三)、酶基因扩增与序列分析
1、β—葡萄糖苷酶基因扩增
反应体系是：10 × PCR反应缓冲液5 μl,dNTP 4 μl，上游引物F和下游引物R各1 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA 聚合酶0.5 μl，加ddH2O补足体积为50 μl。反应步骤是:① 95℃预变性5min；② 94℃变性30s，③ 57℃退火60s，④72℃延伸90s，重复步骤2—4，22个循环;⑤72℃延伸10min.
2、基因与载体的连接
胶回收基因PCR产物，与pGMT连接，转化大肠杆菌，筛选转化子。
3、测序确定葡萄糖苷酶基因的序列
4、利用生物信息学软件分析酶基因序列

五、作业
1、分析基因扩增的琼脂糖凝胶电泳结果。
2、测序获得酶基因序列。