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第五章第五章 正常细胞的培养技术正常细胞的培养技术1可编辑版n正常细胞，不论是来自人或动物的细正常细胞，不论是来自人或动物的细胞，在体外培养时都不易生长，建立胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难，因为它们是已分化的细细胞系更难，因为它们是已分化的细胞，对体外生存条件要求严格，目前胞，对体外生存条件要求严格，目前体外模拟的培养条件都还达不到与体体外模拟的培养条件都还达不到与体内相一致的要求。正常细胞在体外并内相一致的要求。正常细胞在体外并非不能培养，只要各种条件适当仍然非不能培养，只要各种条件适当仍然有培养成功的可能，初代培养较传代有培养成功的可能，初代培养较传代细胞系容易。细胞系容易。2可编辑版n正常细胞培养可用于许多方面，如正常细胞培养可用于许多方面，如研究细胞代谢、物理、化学、生物研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响，作为因素的影响，作为 观察和检测手段观察和检测手段研究活细胞的变化（变异、分化），研究活细胞的变化（变异、分化），可从细胞水平开展亚细胞结构和代可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达，也可大量培养用于谢分子的表达，也可大量培养用于生物制品的生产，等等。生物制品的生产，等等。3可编辑版一、上皮细胞培养一、上皮细胞培养n上皮细胞可来源于外、内、中三个胚上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层，其中来源于内外胚层的上皮细胞层，其中来源于内外胚层的上皮细胞可呈膜状生长。不同器官的上皮细胞可呈膜状生长。不同器官的上皮细胞均具有不同的特定的功能，培养上皮均具有不同的特定的功能，培养上皮细胞不仅有利于研究其功能，还可为细胞不仅有利于研究其功能，还可为烧伤、烫伤的皮肤进行上皮膜层移植，烧伤、烫伤的皮肤进行上皮膜层移植，加速伤口愈合，不留疤痕，在皮肤美加速伤口愈合，不留疤痕，在皮肤美容方面也具有潜在的应用价值。容方面也具有潜在的应用价值。4可编辑版n上皮细胞培养有三个难点：上皮细胞培养有三个难点：n需特殊底物需特殊底物 如需在底层涂以胶原或铺如需在底层涂以胶原或铺上饲养层细胞，以利于生长。上饲养层细胞，以利于生长。n需特殊的培养液需特殊的培养液 如加浓缩维生素及氨如加浓缩维生素及氨基酸的基酸的EMEM及及KGM（培养消化上皮（培养消化上皮细胞）、细胞）、EGM（培养一般上皮细胞）（培养一般上皮细胞）等，价格昂贵。等，价格昂贵。n与上皮细胞混杂的成纤维细胞的过度与上皮细胞混杂的成纤维细胞的过度生长，常常干扰上皮细胞在体外的培生长，常常干扰上皮细胞在体外的培养使其难以长期生存。养使其难以长期生存。5可编辑版n为此，需要从表皮分离、培养液和基为此，需要从表皮分离、培养液和基质底物的选择、增加适当生长因子等质底物的选择、增加适当生长因子等方面着手，以抑制成纤维细胞生长，方面着手，以抑制成纤维细胞生长，促进上皮细胞生长。由此可见，要纯促进上皮细胞生长。由此可见要纯化和延长上皮细胞生存期，抑制成纤化和延长上皮细胞生存期，抑制成纤维细胞生长或去除（或减少）成纤维维细胞生长或去除（或减少）成纤维细胞是上皮细胞培养成功的关键。细胞是上皮细胞培养成功的关键。6可编辑版(一一)表皮细胞分离与培养表皮细胞分离与培养n皮肤是表皮细胞的重要来源，小儿阴皮肤是表皮细胞的重要来源，小儿阴茎包皮是表皮培养的好材料。目前，茎包皮是表皮培养的好材料。目前，全皮培养混有大量成纤维细胞，因而全皮培养混有大量成纤维细胞，因而不采用，常采用皮肤表皮和真皮分离不采用，常采用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞。培养法可获得纯上皮细胞。7可编辑版 （1）无菌条件下切取皮肤标本，以角化）无菌条件下切取皮肤标本，以角化层薄者为佳，早产、流产胎儿皮肤更好。层薄者为佳，早产、流产胎儿皮肤更好。（2）将皮块置于消化液中进行消化，此）将皮块置于消化液中进行消化，此时表皮层与真皮层自然分离，表皮层为浅时表皮层与真皮层自然分离，表皮层为浅棕色，真皮层为白色。棕色，真皮层为白色。（3）取出表皮层再进行第二次消化）取出表皮层再进行第二次消化。（4）待充分消化后，剪碎移至瓶内加入）待充分消化后，剪碎移至瓶内加入适量培养液，吹打分散制成细胞悬液，用适量培养液，吹打分散制成细胞悬液，用不锈钢纱网过滤，调整细胞浓度，用含不锈钢纱网过滤，调整细胞浓度，用含15%胎牛血清的培养液进行分瓶培养，胎牛血清的培养液进行分瓶培养，3天后可见大部分上皮细胞贴壁生长。天后可见大部分上皮细胞贴壁生长。8可编辑版(二二)乳腺上皮细胞分离培养乳腺上皮细胞分离培养n乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集上皮细胞，培养时常用用离心法收集上皮细胞，培养时常用人胚小肠成纤维细胞作饲养层可抑制人胚小肠成纤维细胞作饲养层可抑制间质细胞生长。间质细胞生长。9可编辑版(1)取材，取材，于产后于产后27天收集乳汁天收集乳汁1:1的的比例与培养基混合。比例与培养基混合。(2)低速离心，仔细去除上清，收集细低速离心，仔细去除上清收集细胞。胞。(3)细胞洗涤后置于培养瓶中培养。细胞洗涤后置于培养瓶中培养。(4)35天更换培养基，待细胞长满后可天更换培养基，待细胞长满后可消化、传代消化、传代。10可编辑版 (5)用乳腺细胞培养上皮细胞时，注意：用乳腺细胞培养上皮细胞时，注意：应尽可能去除脂肪组织，应尽可能去除脂肪组织，如果标本如果标本中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获取细胞，取细胞，初时有巨噬细胞存在，可作初时有巨噬细胞存在，可作饲养层细胞，饲养层细胞，培养时也可用经照射或培养时也可用经照射或用丝裂霉素用丝裂霉素C处理过的处理过的3T3细胞作饲养细胞作饲养层细胞，或用胶原层，层细胞，或用胶原层，培养液中也可培养液中也可加刺激生长因子如加刺激生长因子如EGF、胰岛素、氢化、胰岛素、氢化可的松、猪促乳素和前列腺素可的松、猪促乳素和前列腺素E1等，有等，有利于细胞生长繁殖。利于细胞生长繁殖。11可编辑版表皮细胞生长融合成片，并向复层发展表皮细胞生长融合成片，并向复层发展12可编辑版 表皮细胞贴壁生长，呈多边形，不规则表皮细胞贴壁生长，呈多边形，不规则13可编辑版14可编辑版(三三)子宫颈上皮细胞分离培养子宫颈上皮细胞分离培养n子宫颈上皮细胞体外培养在细胞癌前子宫颈上皮细胞体外培养在细胞癌前病变及致癌的研究中有重要意义病变及致癌的研究中有重要意义。n常用组织块法进行原代培养，传代培常用组织块法进行原代培养，传代培养需用经照射或丝裂霉素养需用经照射或丝裂霉素C处理的处理的3T3细胞作滋养层。培养液需添加适当的细胞作滋养层。培养液需添加适当的刺激生长的添加物。刺激生长的添加物。15可编辑版（1）收集活检标本，）收集活检标本，尽可能防止污染。尽可能防止污染。（2）洗涤、剪碎，去除纤维组织。）洗涤、剪碎，去除纤维组织。（3）37培培养养10天天以以上上，组组织织块块贴贴壁壁，加入加入EGF并用此培养液换液。并用此培养液换液。（4）消化、分散、传代培养。）消化、分散、传代培养。16可编辑版(四四)肝细胞分离培养肝细胞分离培养n可用组织块法和原位灌注消化法收获肝细胞可用组织块法和原位灌注消化法收获肝细胞进行原代培养，其形态规则，适于作多种功进行原代培养，其形态规则，适于作多种功能的研究。能的研究。n肝脏原位灌注消化法：从门静脉或其分支中肝脏原位灌注消化法：从门静脉或其分支中插管，用无钙、镁插管，用无钙、镁PBS冲洗肝脏冲洗肝脏15分钟，然后分钟，然后用胶原酶液灌注用胶原酶液灌注15分钟，使纤维组织网被消分钟，使纤维组织网被消化，经过化，经过23次离心分离，可获得大量肝细胞次离心分离，可获得大量肝细胞悬液。悬液。n培养时可将肝细胞接种在游离漂浮的胶原薄培养时可将肝细胞接种在游离漂浮的胶原薄片上，细胞能较好地表达其功能片上，细胞能较好地表达其功能。17可编辑版(五五)胰腺细胞分离胰腺细胞分离n将获取的胰脏标本修剪切碎后消化，将获取的胰脏标本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，经并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，经过过3次离心分离收集细胞，在水浴槽中次离心分离收集细胞，在水浴槽中用旋转法使细胞聚集（用旋转法使细胞聚集（224h），接），接种涂布了胶原的培养皿，可获得体外种涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养的胰腺细胞。培养的胰腺细胞。n此法可用于家鼠和人胰腺细胞培养，此法可用于家鼠和人胰腺细胞培养，培养时采用照射过的肺成纤维细胞作培养时采用照射过的肺成纤维细胞作为饲养层，效果更佳。为饲养层，效果更佳。18可编辑版(六六)气管及支气管上皮细胞分离培养气管及支气管上皮细胞分离培养n在血清存在条件下，正常人气管上皮在血清存在条件下，正常人气管上皮细胞停止分裂和生长分化，因此需用细胞停止分裂和生长分化，因此需用无血清培养基无血清培养基(LHC-9),),可使组织碎块的可使组织碎块的气管上皮细胞生长，并且抑制纤维细气管上皮细胞生长，并且抑制纤维细胞生长。胞生长。19可编辑版(七七)前列腺细胞培养前列腺细胞培养n前列腺细胞的培养，关键是改良培养前列腺细胞的培养，关键是改良培养液的成分，加入激素样生长因子，以液的成分，加入激素样生长因子，以刺激前列腺细胞生长，抑制纤维细胞刺激前列腺细胞生长，抑制纤维细胞生长，可用于研究前列腺的生长和功生长，可用于研究前列腺的生长和功能。能。20可编辑版(八八)口腔粘膜上皮细胞培养口腔粘膜上皮细胞培养n口腔粘膜上皮为复层鳞状上皮，体外培养口腔粘膜上皮为复层鳞状上皮，体外培养口腔粘膜上皮细胞的关键是：用胶原酶消口腔粘膜上皮细胞的关键是：用胶原酶消化法使鳞状上皮细胞层与底层的间质分开，化法使鳞状上皮细胞层与底层的间质分开，再进一步用胰蛋白酶消化法使鳞状上皮细再进一步用胰蛋白酶消化法使鳞状上皮细胞分离为单细胞悬液，然后在角化细胞培胞分离为单细胞悬液，然后在角化细胞培养液养液(KGM)中培养。中培养。21可编辑版(九九)胃上皮细胞培养胃上皮细胞培养n培养正常人胃上皮细胞对研究胃癌癌变机理有很培养正常人胃上皮细胞对研究胃癌癌变机理有很大应用价值。但培养难度大，培养成功要注重三大应用价值。但培养难度大，培养成功要注重三点：第一，用胶原酶和透明质酸酶消化法，并用点：第一，用胶原酶和透明质酸酶消化法，并用消化细胞；第二，应用胶原底物培养；第三，制消化细胞；第二，应用胶原底物培养；第三，制备含有特定成分的培养基。备含有特定成分的培养基。n胃胃上上皮皮细细胞胞培培养养多多加加血血清清并并不不能能促促进进细细胞胞生生长长，可可能能与与血血清清中中含含有有抑抑制制上上皮皮细细胞胞生生长长的的TGF-1有有关关。完完全全培培养养基基中中添添加加的的许许多多种种成成分分和和生生长长因因子子，可可利利于于上上皮皮细细胞胞生生长长，而而且且呈呈现现对对胞胞外外基基质质ECM的依赖性，尤以的依赖性，尤以型胶原对胃上皮细胞作用更好。型胶原对胃上皮细胞作用更好。22可编辑版 二、中胚层细胞培养二、中胚层细胞培养n中胚层细胞培养包括结缔组织、肌中胚层细胞培养包括结缔组织、肌肉组织、骨组织、骨髓细胞、内皮肉组织、骨组织、骨髓细胞、内皮细胞、血细胞等的培养。细胞、血细胞等的培养。23可编辑版(一一)结缔组织细胞结缔组织细胞n在在细细胞胞培培养养中中包包括括人人在在内内的的结结缔缔组组织织细细胞胞(如如成成纤纤维维细细胞胞等等)都都很很容容易易培培养养成成功功，也也是是其其他他组组织织培培养养时时的的副副产产物物，无无需需特特殊殊的的培培养养条条件件，常常规规培培养养即即可可。其其生生物物学学特特性性稳稳定定，不不易易发发生生转转化化，成成为为二二倍倍体体细细胞胞的的主主要要来来源源，人人的的二二倍倍体体细细胞胞系系主主要要为为成成纤纤维维细细胞胞。为为获获取取大大量量成成纤纤维维细细胞胞，用用人人和和动动物物胚胚体体为为好好。动动物物可可用用鼠鼠胚胚或或鸡鸡胚胚，人人胚胚可可取取皮皮肤肤(包包皮皮或或胎胎儿儿皮皮肤肤)、肺肺、肾肾，这些都是很好的研究和应用对象。这些都是很好的研究和应用对象。24可编辑版1、人胚肺细胞分离培养、人胚肺细胞分离培养n人胚肺细胞可建立二倍体细胞系，可用于人胚肺细胞可建立二倍体细胞系，可用于病毒疫苗的生产和研究，还可用来生产病毒疫苗的生产和研究，还可用来生产-干扰素干扰素(IFN-)等生物制品。等生物制品。n传代培养能稳定生长，但有寿命限制，一传代培养能稳定生长，但有寿命限制，一般可连续传至般可连续传至6515代左右。染色体数为代左右。染色体数为2n=46条，通常以条，通常以1:2传代后，一周内可形成传代后，一周内可形成单层，其形态和生长特性稳定，无致瘤性，单层，其形态和生长特性稳定，无致瘤性，对某些病毒敏感，但本身无潜在病毒和支对某些病毒敏感，但本身无潜在病毒和支原体污染。国际公认的人胚肺二倍体细胞原体污染。国际公认的人胚肺二倍体细胞系为系为WI-38和和MRC-5等。等。25可编辑版 人胚肺细胞的分离和培养方法如下：人胚肺细胞的分离和培养方法如下：(1)取取妊妊娠娠35个个月月人人工工流流产产的的正正常常胎胎 儿，无菌取肺组织。儿，无菌取肺组织。(2)洗洗涤涤、剪剪切切、消消化化，常常规规培培养养，注注 意意观观察察细细胞胞的的形形态态、密密度度变变化化，及及时时换液、传代。换液、传代。26可编辑版2、人胚肾细胞分离培养、人胚肾细胞分离培养n人胚肾细胞利用肾脏的皮质细胞经胰蛋白人胚肾细胞利用肾脏的皮质细胞经胰蛋白酶消化分散后制成，该细胞呈类梭形，细酶消化分散后制成，该细胞呈类梭形，细胞界限较模糊，消化时间要控制好，原代胞界限较模糊，消化时间要控制好，原代培养时血清浓度以培养时血清浓度以20%为宜，贴壁较牢固，为宜，贴壁较牢固，传代培养时，消化时间可适当延长。传代培养时，消化时间可适当延长。n细胞来自于妊娠细胞来自于妊娠35个月人工流产的正常个月人工流产的正常胎儿胎儿，无菌取得。，无菌取得。27可编辑版3、人羊膜细胞分离培养、人羊膜细胞分离培养n人羊膜细胞目前已建立了细胞系，通人羊膜细胞目前已建立了细胞系，通过转化后，可以无限制传代，常用过转化后，可以无限制传代，常用FL、Wish人羊膜细胞分离、繁殖某些病毒，人羊膜细胞分离、繁殖某些病毒，并用来测定干扰素的效价。并用来测定干扰素的效价。n正常的人羊膜细胞也易于培养。正常的人羊膜细胞也易于培养。细胞细胞来自于剖腹产顺产胎儿或新生儿的来自于剖腹产、顺产胎儿或新生儿的胎盘胎盘中的羊膜。中的羊膜。28可编辑版4、实验室也经常使用幼地鼠肾细胞、实验室也经常使用幼地鼠肾细胞、鼠胚及地鼠胚成纤维细胞、鸡胚纤维鼠胚及地鼠胚成纤维细胞、鸡胚纤维母细胞等，这些细胞的分离培养与人母细胞等，这些细胞的分离培养与人细胞的分离培养基本方法是一样的。细胞的分离培养基本方法是一样的。29可编辑版(二二)肌肉组织细胞肌肉组织细胞n骨骨骼骼肌肌、心心肌肌和和平平滑滑肌肌细细胞胞都都可可在在体体外外培培养养中中生生长长，心心肌肌细细胞胞在在培培养养的的最最初初几几天天还还具具有有自自动动节节律律性性收收缩缩功功能能，传传代代培培养养时时可可能能会会逐逐渐渐丧丧失失这这种种功功能能。平平滑滑肌肌细细胞胞可可通通过过胰胰蛋蛋白白酶酶或或胶胶原原酶酶消消化化法法从从血血管管气气管管壁壁及肠壁中获得。骨骼肌可从四肢中获得。及肠壁中获得。骨骼肌可从四肢中获得。n肌肌细细胞胞含含有有数数种种抗抗原原标标记记物物，如如肌肌浆浆球球蛋蛋白白、原原肌肌凝凝蛋蛋白白等等。肌肌动动蛋蛋白白等等可可在在大大多多数数细细胞胞中中发发现现，但但并并非非细细胞胞的的特特有有标标记记物物，肌细胞分化时肌酸磷酸酶活性升高肌细胞分化时肌酸磷酸酶活性升高。30可编辑版1、骨骼肌细胞分离培养、骨骼肌细胞分离培养n动动物物胚胚或或幼幼体体四四肢肢，特特别别是是大大腿腿肌肌组组织织为为最最好好的的培培养养材材料料，取取材材常常用用生生后后12天天的的乳乳鼠鼠（Wistar大大鼠鼠更更好好）。人人骨骨骼骼肌肌细细胞胞来来源源最最好好是是人人工工流流产产的的孕孕期为期为35个月的健康胎儿肢体。个月的健康胎儿肢体。31可编辑版n无菌取肌组织，洗涤、剪切、消化。无菌取肌组织，洗涤、剪切、消化。n常规培养，注意观察细胞形态、数量常规培养，注意观察细胞形态、数量的变化，及时换液、传代。的变化，及时换液、传代。n肌肉细胞成片后，可用胰蛋白酶消化肌肉细胞成片后，可用胰蛋白酶消化分散，进行传代培养，可传分散，进行传代培养，可传1020代。代。32可编辑版2、心肌细胞培养、心肌细胞培养n心肌组织是最早利用的培养材料之一，心肌组织是最早利用的培养材料之一，最常用的是孵育最常用的是孵育1012天的鸡胚心肌，天的鸡胚心肌，新生大鼠、乳鼠及人胎儿心肌等。心新生大鼠、乳鼠及人胎儿心肌等。心肌是比较容易培养和生长的组织，可肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如悬滴培养、应用多种方法进行培养，如悬滴培养、组织块培养和消化培养法等。主要是组织块培养和消化培养法等。主要是取心室肌培养，消化分离方法与前相取心室肌培养，消化分离方法与前相同。同。33可编辑版(三三)各种骨细胞分离培养各种骨细胞分离培养n包括软骨细胞分离培养、成骨细胞分包括软骨细胞分离培养、成骨细胞分离培养和破骨细胞分离培养等。离培养和破骨细胞分离培养等。34可编辑版1、软骨细胞分离培养、软骨细胞分离培养n软软骨骨分分为为生生长长部部和和休休止止部部，其其中中生生长长部部软软骨骨细细胞胞在在体体外外培培养养条条件件下下代代谢谢较较活活跃跃，具具有有形形成成软软骨骨基基质质的的功功能能和和成成骨细胞的某些特性。骨细胞的某些特性。n软软骨骨细细胞胞埋埋藏藏于于致致密密的的糖糖蛋蛋白白软软骨骨基基质质中中，必必须须经经过过一一系系列列酶酶消消化化,才才能能获获得得少少量量细细胞胞，在在呈呈弱弱碱碱性性并并增增加加Mg+浓度的培养液中易于生长浓度的培养液中易于生长。35可编辑版n操作要点是：切碎软骨组织，用透明质酸酶、操作要点是：切碎软骨组织，用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶消化两遍以除去基质，再胰蛋白酶和胶原酶消化两遍以除去基质，再用胶原酶长时间消化，收集细胞，按常规贴用胶原酶长时间消化，收集细胞，按常规贴壁单层细胞培养法，培养于弱碱性的壁单层细胞培养法，培养于弱碱性的F12培培养液中。养液中。n体体外外培培养养的的软软骨骨细细胞胞，很很像像上上皮皮样样细细胞胞，可可形形成成具具有有折折光光性性的的细细胞胞外外基基质质，经经甲甲苯苯胺胺兰兰染色呈异染性。染色呈异染性。n细胞组织化学染色：软骨细胞可以特异性合细胞组织化学染色：软骨细胞可以特异性合成葡萄糖胺聚糖成葡萄糖胺聚糖(GAG),),型和型和型胶原，并型胶原，并具有碱性磷酸酶活性具有碱性磷酸酶活性(免疫组化阳性免疫组化阳性)，也可，也可用定量法测出其含量。用定量法测出其含量。36可编辑版2、成骨细胞分离培养、成骨细胞分离培养n骨细胞是一种终末化的细胞，埋藏于骨基质中，从骨细胞是一种终末化的细胞，埋藏于骨基质中，从皮质骨中分离培养骨细胞至今未见报导，只是在胎皮质骨中分离培养骨细胞至今未见报导，只是在胎鼠或鸡胚颅骨细胞培养时见到少量星状细胞，呈花鼠或鸡胚颅骨细胞培养时见到少量星状细胞，呈花边样网状结构。在某些激素边样网状结构。在某些激素(如甲状旁腺素如甲状旁腺素)的作用的作用下或无血清培养中，这些细胞可变为圆形，二羟基下或无血清培养中，这些细胞可变为圆形，二羟基维生素维生素D3可以刺激某些成骨样细胞变为星状。骨细可以刺激某些成骨样细胞变为星状。骨细胞可以和成骨细胞一起从胎鼠或鸡胚颅盖骨上分离胞可以和成骨细胞一起从胎鼠或鸡胚颅盖骨上分离出来，也可由体外培养的成骨细胞分化而来，出来，也可由体外培养的成骨细胞分化而来，OB7.3阳性的细胞刚分离时为圆形，贴壁生长变为星形，阳性的细胞刚分离时为圆形，贴壁生长变为星形，具有胞浆突起，数日后胞突连成网状，使星形细胞具有胞浆突起，数日后胞突连成网状，使星形细胞相互连接，不依赖于细胞外基质。相互连接，不依赖于细胞外基质。37可编辑版n成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，用骨组织块法、酶消化法、骨困难，用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织法、骨髓培养法以及薄层骨片膜组织法、骨髓培养法以及薄层骨片经经EDTA处理，并经胶原酶消化，均可处理，并经胶原酶消化，均可分离培养出成骨细胞，体外培养的成分离培养出成骨细胞，体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特性。骨细胞保持有骨组织细胞的某些特性。38可编辑版3、破骨细胞分离培养、破骨细胞分离培养n破破骨骨细细胞胞的的研研究究表表明明，脾脾脏脏和和骨骨髓髓中中单单个个核核细细胞胞可可以以互互相相融融合合形形成成多多核核的的破破骨骨细细胞胞，随随血血流流到到达达破破骨骨细细胞胞活活动动活活跃跃的的部部位位在在新新生生动动物物的的长长骨骨内内面面反反复复冲冲洗洗或或用用胶胶原原酶酶消消化化，新新生生动动物物的的颅颅盖盖骨骨都都可可获获得得破破骨骨细细胞胞，用用骨骨髓髓培培养养法法也也可可使使单个核细胞分化为破骨细胞。单个核细胞分化为破骨细胞。39可编辑版(四四)骨髓细胞的分离培养骨髓细胞的分离培养n骨骨髓髓可可分分为为造造血血干干/祖祖细细胞胞和和基基质质细细胞胞两两类类，均均可可在在体体外外进进行行培培养养，扩扩增增和和开展细胞定向分化的研究。开展细胞定向分化的研究。40可编辑版n骨髓基质细胞在骨髓中可为造血干骨髓基质细胞在骨髓中可为造血干/祖细胞祖细胞提供微环境，可分泌许多种细胞因子，对提供微环境，可分泌许多种细胞因子，对造血干造血干/祖细胞的分化起着独特的支持作用。祖细胞的分化起着独特的支持作用。此外，骨髓基质细胞还与成骨效应密切相此外，骨髓基质细胞还与成骨效应密切相关，目前认为骨髓基质细胞有内皮细胞、关，目前认为骨髓基质细胞有内皮细胞、平滑肌细胞、网状细胞、脂肪细胞或骨细平滑肌细胞、网状细胞、脂肪细胞或骨细胞和破骨细胞等，因此，对开展成骨效应、胞和破骨细胞等，因此，对开展成骨效应、成骨细胞分化和上述各类细胞的分离、鉴成骨细胞分化和上述各类细胞的分离、鉴定及其功能的实验研究，已引起科研人员定及其功能的实验研究，已引起科研人员和临床医生的极大兴趣。体外大量扩增骨和临床医生的极大兴趣。体外大量扩增骨髓基质细胞应用于临床治疗骨不连及软骨髓基质细胞应用于临床治疗骨不连及软骨缺损具有广阔的应用前景。缺损具有广阔的应用前景。41可编辑版1、骨髓细胞来源、骨髓细胞来源n新新生生动动物物及及胚胚胎胎骨骨的的骨骨髓髓，人人和和胎胎儿儿的的骨骨髓髓，成成人人取取自自术术后后骨骨，胎胎儿儿取取自自流流产产胎胎儿儿骨骨的的骨骨髓髓或或临临床床上上抽骨髓检查时剩余的骨髓或自愿供骨髓者。抽骨髓检查时剩余的骨髓或自愿供骨髓者。2、骨髓细胞的分离培养、骨髓细胞的分离培养n骨髓中的细胞，一类为不能贴壁、在培养基中悬浮骨髓中的细胞，一类为不能贴壁、在培养基中悬浮生长的造血干生长的造血干/祖细胞、淋巴细胞、红细胞，另一祖细胞、淋巴细胞、红细胞，另一类为能缓慢贴壁生长的骨髓基质细胞，这两类细胞类为能缓慢贴壁生长的骨髓基质细胞，这两类细胞不仅形态上有明显差异，而且分离培养方法、条件不仅形态上有明显差异，而且分离培养方法、条件以及功能应用性研究也有所不同。以及功能应用性研究也有所不同。42可编辑版体外培养的骨髓细胞中红系集落形成单体外培养的骨髓细胞中红系集落形成单位（位（CFUE）43可编辑版体外培养的骨髓细胞中单核体外培养的骨髓细胞中单核巨噬细胞集落巨噬细胞集落形成单位（形成单位（CFUGM）44可编辑版培养培养4d的骨的骨髓基质细胞伸展生长、呈长髓基质细胞伸展生长、呈长菱形肌样外观菱形肌样外观45可编辑版培养培养1周的骨髓基质肌样细胞（网状）周的骨髓基质肌样细胞（网状）46可编辑版n悬浮生长的造血干悬浮生长的造血干/祖细胞，若在骨髓培养祖细胞，若在骨髓培养的细胞中加入不同细胞因子，如的细胞中加入不同细胞因子，如G-CSF或或M-CSF或或EPO，同时均加入，同时均加入IL-3、IL-6，在软，在软琼脂和甲基纤维素半固体培养基的琼脂和甲基纤维素半固体培养基的24孔孔板中板中可形成不同的集落，这种试验既可用于测定可形成不同的集落，这种试验既可用于测定细胞因子的效价，又可检查骨髓细胞的造血细胞因子的效价，又可检查骨髓细胞的造血功能，同时也可从细胞中抽提总功能，同时也可从细胞中抽提总RNA，通过，通过RT-PCR，可克隆相应的基因。此外，还可，可克隆相应的基因。此外，还可用于测定对化疗药物的敏感性和耐药性用于测定对化疗药物的敏感性和耐药性。47可编辑版n这些细胞在多种细胞因子的作用下，这些细胞在多种细胞因子的作用下，其中的造血干细胞在体外既保持其其中的造血干细胞在体外既保持其分化潜能又大量扩增，可用于骨髓分化潜能又大量扩增，可用于骨髓移植。移植。48可编辑版n经经体体外外培培养养贴贴壁壁的的骨骨髓髓基基质质细细胞胞，可可用用于于细细胞胞因因子子自自分分泌泌和和诱诱导导分分泌泌能能力力的的测测试试。骨骨髓髓基基质质细细胞胞能能分分泌泌多多种种调调节节免免疫疫和和造造血血功功能能的的细细胞胞因因子子，证证明明基基质质细细胞胞能能支支持持造造血血、提提供供造造血血微微环环境境，也也为为体体外外扩扩增增干干细细胞胞用用于于骨骨髓髓移移植植提提供供了了新新技技术术、新新方方法法。扩扩增增的的基基质质细细胞胞不不仅仅可可直直接接应应用用于于临临床床治治疗疗骨骨髓髓抑抑制制、成成骨骨能能力力障障碍碍性性疾疾病病，而而且且可可通通过过基基因因导导入入法法开展基因治疗的研究。开展基因治疗的研究。49可编辑版（五）内皮细胞的分离培养（五）内皮细胞的分离培养n内皮细胞在血管内形成单层内表面，标本来内皮细胞在血管内形成单层内表面，标本来源多为牛主动脉、牛肾上腺皮质毛细血管、源多为牛主动脉牛肾上腺皮质毛细血管、鼠脑皮质毛细血管、人脐静脉以及人皮肤和鼠脑皮质毛细血管、人脐静脉以及人皮肤和脂肪的毛细血管。采用血管内注入胶原酶的脂肪的毛细血管。采用血管内注入胶原酶的灌流消化法，可使内皮细胞分离，然后培养灌流消化法，可使内皮细胞分离，然后培养在铺有明胶基质的培养器皿中，如果标本来在铺有明胶基质的培养器皿中，如果标本来源是毛细血管，培养时需加入有丝分裂原，源是毛细血管，培养时需加入有丝分裂原，若来源于大血管则不用加。内皮细胞易于从若来源于大血管则不用加。内皮细胞易于从血管分离进行培养成单层，对研究内皮细胞血管分离进行培养成单层，对研究内皮细胞再生长、肿瘤促血管生长再生长、肿瘤促血管生长因子（因子（TAF）等有等有很大应用价值。很大应用价值。50可编辑版(六六)血液细胞分离培养血液细胞分离培养n正常血细胞在体外培养生长时间短，正常血细胞在体外培养生长时间短，只有白血病、血友病、淋巴瘤细胞可只有白血病、血友病、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系，但多半为培养成功并建立细胞系，但多半为EB病毒等致瘤病毒引起的转化细胞病毒等致瘤病毒引起的转化细胞(EBNA检查阳性检查阳性)，DMSO处理也可诱处理也可诱导这些细胞分化发生逆转，转化为正导这些细胞分化发生逆转，转化为正常细胞。所建立的细胞系多半为单核常细胞。所建立的细胞系多半为单核细胞系、细胞系、B淋巴细胞系、淋巴细胞系、T淋巴细胞，淋巴细胞，在在IL-2产品问世后，产品问世后，T细胞也可在体细胞也可在体外外建系、建株。建系、建株。51可编辑版n血细胞可从外周血中用梯度分离液通血细胞可从外周血中用梯度分离液通过离心分层后分离获得，也可从脾脏、过离心分层后分离获得，也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞，从腹腔刺激后的分离获得淋巴细胞，从腹腔刺激后的冲洗液中可获得多量的单核一巨噬细冲洗液中可获得多量的单核一巨噬细胞，从骨髓中可以获得前体血细胞，胞，从骨髓中可以获得前体血细胞，并可长期培养生长，加入生长因子或并可长期培养生长，加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖。和生长繁殖。52可编辑版1、外周血细胞分离培养、外周血细胞分离培养n外外周周血血中中除除红红细细胞胞外外，还还有有粒粒细细胞胞、单单核核细细胞胞和和淋淋巴巴细细胞胞及及血血小小板板等等，通通常常是是分分离离白白细细胞胞、淋淋巴巴细细胞胞、血血小小板板的的重重要要来来源源。其其分分离离方方法法有有四四种种：即即自自然然沉沉降降法法、差差异异沉沉降降法法、氧氧化化分分离离法、法、Ficoll分层法。分层法。53可编辑版nFicoll分离法分离法 采用采用Ficoll和泛影葡胺配和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同比离心后可使血细胞以不同比重将其分离开，如分离淋巴细胞可选重将其分离开，如分离淋巴细胞可选用比重用比重1.077的分离液，若分离血小板的分离液，若分离血小板可用比重可用比重1.090的分离液，若分离骨髓的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用中的单核细胞常用1.120比重比重的分离液。的分离液。54可编辑版外周血中淋巴细胞的分离外周血中淋巴细胞的分离1500rpm,20,30min55可编辑版2、淋巴器官中的淋巴细胞的分离、淋巴器官中的淋巴细胞的分离n从从人人脾脾脏脏、淋淋巴巴结结、扁扁桃桃体体或或胸胸腺腺等等器器官官中中制制备备淋淋巴巴细细胞胞悬悬液液，在在免免疫疫学学研究中是经常需要的。研究中是经常需要的。n将将淋淋巴巴器器官官剪剪成成碎碎块块，用用镊镊子子压压挤挤或或在在金金属属丝丝网网上上研研磨磨，或或用用玻玻璃璃匀匀浆浆器器研研磨磨，制制成成悬悬液液，再再用用Ficoll分分离离法法分分离细胞，洗涤、计数，备用。离细胞，洗涤、计数，备用。56可编辑版n用用上上述述分分离离法法所所获获得得的的细细胞胞、淋淋巴巴细细胞胞，可可用用于于白白细细胞胞粘粘附附移移动动试试验验、转转化化试试验验、细细胞胞毒毒试试验验，同同时时用用于于细细胞胞因因子子的的诱诱生生和和制制备备，或或扩扩增增外外周周血血造造血血细细胞胞、树树突突状状细细胞胞、LAK细细胞胞、T细胞等供细胞移植用。细胞等，供细胞移植用。57可编辑版3、人脐带血细胞分离培养、人脐带血细胞分离培养n人人脐脐带带血血来来源源方方便便，脐脐血血的的血血浆浆中中富富含含许许多多高高水水平平的的造造血血活活性性物物质质，具具有有刺刺激激和和促促进进骨骨髓髓造造血血干干/祖祖细细胞胞增增殖殖、分分化化和和再再植植能能力力，是是造造血血生生长长因因子子的的重重要要来源。来源。n脐脐血血中中富富含含类类似似于于骨骨髓髓的的造造血血干干细细胞胞，具具有有很很强强的的自自我我复复制制和和再再植植能能力力。脐脐血血中中还还含含有有类类似似于于骨骨髓髓的的基基质质细细胞胞，对对骨骨髓髓造造血血具具有有支支持持作作用用，在在体体外外培培养养扩扩增增中中具具有有更更大大的的增增殖殖能能力力，是是造造血血干干细细胞胞移移植植的的理理想想来来源源，已已被被应应用用于于许许多多血血液液病病和和恶恶性性肿肿瘤瘤的的治治疗疗，并并容容易易获获得得骨骨髓髓造造血血功功能能的的重重建建。目目前前，不不少少单位建立脐血库，以不断满足研究和临床应用。单位建立脐血库，以不断满足研究和临床应用。58可编辑版4、巨噬细胞分离培养、巨噬细胞分离培养n巨巨噬噬细细胞胞是是免免疫疫应应答答中中重重要要的的APC和和非非特特异异性性吞吞噬噬细细胞胞，是是研研究究细细胞胞吞吞噬噬、细细胞胞免免疫疫和和分分子子免免疫疫学学的的重重要要对对象象。该该细细胞胞易易得得、易易培培养养。人人巨巨噬噬细细胞胞难难以以长长期期生生长长，多多用用作作初初代代培养。培养。n巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血液和透巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血液和透析液等，实验动物多从血液、肺、脾和胸腹析液等，实验动物多从血液、肺、脾和胸腹腔获取，通常采用预洗注入刺激物后再采集，腔获取，通常采用预洗注入刺激物后再采集，以小鼠腹腔取材法最为实用。以小鼠腹腔取材法最为实用。59可编辑版三、神经外胚层细胞培养三、神经外胚层细胞培养n神经组织主要由神经细胞（神经元）神经组织主要由神经细胞（神经元）和神经胶质细胞组成。神经元为高度和神经胶质细胞组成。神经元为高度分化的细胞已失去增殖能力，对生分化的细胞，已失去增殖能力，对生存条件要求高，只有在适宜情况下，存条件要求高，只有在适宜情况下，和经特殊处理的器皿中方可生长。和经特殊处理的器皿中方可生长。n神经胶质细胞较易培养，它分为少突、神经胶质细胞较易培养，它分为少突、星形和小胶质三种。星形和小胶质三种。60可编辑版(一一)神经原细胞分离培养神经原细胞分离培养n从从出出生生48天天的的大大鼠鼠脑脑组组织织取取材材培培养养，培培养养液液中中加加入入胞胞嘧嘧啶啶阿阿拉拉伯伯糖糖抑抑制制非非神神经经元元细细胞胞，可可获获得得特特征征明明显显的的脑脑神神经细胞。经细胞。61可编辑版(二二)神经胶质细胞分离培养神经胶质细胞分离培养n与神经元细胞相比，神经胶质细胞较与神经元细胞相比，神经胶质细胞较容易在体外培养生长。用常规的组织容易在体外培养生长。用常规的组织块法、胰酶消化法、胶原酶消化法都块法、胰酶消化法、胶原酶消化法都可从幼年或成年动物及人的脑组织标可从幼年或成年动物及人的脑组织标本中培养出神经胶质细胞，而且生长本中培养出神经胶质细胞，而且生长稳定，不易发生自发转化，可建立起稳定，不易发生自发转化，可建立起能传代的二倍体细胞系。能传代的二倍体细胞系。62可编辑版(三三)黑色素细胞分离培养黑色素细胞分离培养n黑色素细胞来源于神经嵴的树突细胞。黑色素黑色素细胞来源于神经嵴的树突细胞。黑色素细胞是在皮肤表皮细胞培养的基础上发展起来细胞是在皮肤表皮细胞培养的基础上发展起来的，黑色素细胞培养对研究和治疗色素异常性的，黑色素细胞培养对研究和治疗色素异常性皮肤病皮肤病(如白癜风如白癜风)有重要意义。其基本原理和有重要意义。其基本原理和方法是：用胰蛋白酶消化法使表皮和真皮分离方法是：用胰蛋白酶消化法使表皮和真皮分离，用机械法从表皮的内面获得黑色素细胞，在，用机械法从表皮的内面获得黑色素细胞，在添加适当成分的培养基中培养。添加适当成分的培养基中培养。n黑黑色色素素细细胞胞具具有有产产生生黑黑色色素素的的功功能能，多多巴巴胺胺反反应呈阳性。应呈阳性。63可编辑版