化学发光磁酶免疫分析法检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌.pdf

144食品安全与检测2.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南郑州450 0 0 1；3.桃城区动物防疫站，河北衡水0 530 0 0)摘要：建立化学发光磁酶免疫分析法检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌，并优化化学发光条件和免疫反应条件。结果表明：最佳发光条件为鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚的浓度分别为5.0 10-3、1.7610-2、5.0 10-3mo l/L,辣根过氧化物酶的质量浓度为5.0 10-5mg/mL；最佳免疫条件为免疫磁珠用量50 L、一抗体积稀释比1：8 0 0 0；方法的检出限为3.0 10 3CFU/mL，回收率为87.94%113.04%。建立的方法可用于牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的检测。关键词：化学发光磁酶免疫分析法；鼠伤寒沙门氏菌；牛奶Detection of Salmonella typhimurium in milk bychemiluminescence magnetic enzyme immunoassay methodJIE Ming-sha?2,LAN Sheng-kai,WAN Jia-yun,LI Xin-yan(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,2.Henan Key Laboratory of Cold Chain Food Quality and Safety Control,3.Animal Epidemic Prevention Station of Taocheng District,Hengshui 053000,Hebei,China)Abstract:A chemiluminescence magnetic enzyme immunoassay method was established for the detectionof Salmonella typhimurium in milk,and the chemiluminescence and immune reaction conditions were opti-mized.The results showed that the optimal chemiluminescence conditions were as follows:the concentra-tions of luminol,hydrogen peroxide,and p-iodophenol were 5.0 10-3,1.76 10-2,5.0 10-3 mol/Lrespectively,and the mass concentration of horseradish peroxidase was 5.0 x10-5 mg/mL.The optimalimmune reaction conditions were dosage of immunomagnetic beads was 50 L and dilution volume ratio ofprimary antibody was 1:8 000.The detection limit of the method was 3.0 x103 CFU/mL,with a recov-ery rate of 87.94%-113.04%.The established method can be used for the detection of Salmonella ty-phimurium in milk.Key words:chemiluminescence magnetic enzyme immunoassay method;Salmonella typhimurium;milk中图分类号：TS252.7鼠伤寒沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，能够引起胃肠炎、败血症和伤寒等感染性疾病,其传播途径主要为动物源性食品，如肉、蛋、奶、水产品等 1-3。化学发光免疫分析是继放射免疫分析、收稿日期：2 0 2 2-11-0 7基金项目：河南省科技攻关项目（2 32 10 2 1110 7 1、2 0 2 10 2 110 140）作者简介：介明沙（19 8 6 一），女，博士，讲师，研究方向为食品安全质量检测。粮食与油脂化学发光磁酶免疫分析法检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌介明沙12，蓝晟恺，万嘉芸，李新燕”（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州450 0 0 1；Zhengzhou 450001,Henan,China;Zhengzhou 450001,Henan,China;文献标志码：A2023年第36 卷第11期文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)11-0 144-0 5酶免疫分析和荧光免疫分析之后发展起来的新型免疫检测技术 4-5。化学发光免疫分析具有无散射光干扰、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短等优点，广泛应用于食品安全检测领域，尤其是对食源2023年第36 卷第11期性致病菌的检测 6-8 。在化学发光免疫分析中引人经抗体或适配体修饰的超顺磁性纳米颗粒，有助于快速捕获目标物，同时起到分离富集和信号放大的作用,进而缩短检测时间、提高检测灵敏度。目前,基于免疫磁纳米颗粒的化学发光磁酶免疫分析（CLME-IA)已应用于不同食品污染物的检测中 9-1本研究以鼠伤寒沙门氏菌为待测目标物,采用免疫磁分离技术分离富集目标物，通过优化化学发光底物体系和免疫反应条件，建立CLMEIA法快速检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的方法,以期为牛奶中鼠伤寒沙门氏菌污染探索快速灵敏的检测方法提供参考。1材料与方法1.1 材料与试剂鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、单核增生李斯特菌（ATCC15313）、大肠杆菌0 157：H7（A T CC438 9 5），广东省微生物菌种保藏中心；鼠伤寒沙门氏菌单抗、生物素标记沙门氏菌多抗，美国Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP，30 0 U/m g）、磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，p H 7.4），北京索莱宝科技有限公司；HRP标记的羊抗小鼠IgG,北京博奥森生物技术有限公司；链霉亲和素磁珠（2.8 m，10 mg/mL），无锡百迈格生物科技有限公司;鲁米诺（luminol，质量分数97%），美国Sigma-Aldrich公司；对碘苯酚（PIP，质量分数9 8%）、质量分数30%H,02、吐温2 0，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白陈大豆肉汤，青岛海博生物技术有限公司；纯牛奶，市售；磷酸盐洗液（PBS T，含体积分数0.0 5%吐温2 0 的PBS溶液），实验室自制。1.2仪器与设备Spark20M型多功能微孔板读数仪,瑞士Tecan有限公司；BJ-2CD型超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SHP-250型恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司；ME204/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T6型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1菌种的复苏将盛有鼠伤寒沙门氏菌菌种冻干粉的容器置于超净工作台上，向其中加入50 0 L灭菌后的新鲜胰蛋白陈大豆肉汤，用移液枪吹打混匀后，采用接种环取适量冻干粉悬液，接种到液体培养基中，于粮食与油脂37恒温摇床中培养2 4h后取出，观察培养基表面是否有其他杂菌，确保无其他杂菌后方可进行后续试验。1.3.2免疫磁珠的制备取7.6 mL0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)于离心管中,向其中加入40 0 L链霉亲和素磁珠，混合均匀后加人40 0 L已10 倍体积稀释的生物素标记沙门氏菌多抗,在37 恒温摇床中孵育 3 h后,置于4冰箱中备用。1.3.3鼠伤寒沙门氏菌的测定（1)将免疫磁珠按50 L/孔的量,加入到9 6 孔板中,放置于磁分离板上分离3min,弃上清液，向其中添加特定稀释度的菌液（10 0 L/孔），盖上盖子，在37 恒温培养箱中孵育 6 0 min。(2)利用磁性分离板将免疫磁珠与菌体复合物磁分离后，弃上清液，向其中加人30 0 L/孔的0.01mol/LPBST洗液（含体积分数0.0 5%吐温20的PBS溶液)充分振荡,洗板2 次。向9 6 孔板中加入10 0 L鼠伤寒沙门氏菌单抗（一抗）体积稀释液（鼠伤寒沙门氏菌单抗与PBST按体积比1：10000稀释）,于37 恒温培养箱中孵育6 0 min。（3)孵育结束后,用磁分离板将免疫磁珠-菌体-一抗复合物磁分离3min后，弃上清液,用PBST溶液洗板2 次。向孔板中加人10 0 LHRP标记的羊抗小鼠IgG稀释液（HRP标记单抗小鼠IgG与PBST按体积比1：10 0 0 0 稀释），于37 恒温培养箱中孵育6 0 min后，磁分离3min，弃上清液，用PBST溶液洗板4次。（4）每孔分别加人化学发光底物A（最佳lumi-nol浓度和最佳PIP浓度的混合溶液）、B（H,O 溶液）各10 0 L,避光反应后检测各孔的化学发光情况，平行测定3次，记录其相对光单位（RLU）。1.3.4化学发光底物单因素试验化学发光底物体系单因素试验的基础条件为5.010=3mol/Lluminol 溶液、1.7 6 10-mol/LH,0,溶液、5.0 10-5mg/mLHRP溶液、5.0 10-3mol/L PIP 溶液;考察范围分别为 5.0 10-7 1.0 10-2 mol/L8.8 10-4 7.06 10-mol/L、1.0 10-6 1.0 10-4 mg/mL、5.0 10 -7 1.0 10-2 mol/L;依次研究luminol 浓度、H,O,浓度、HRP质量浓度、PIP浓度对化学发光底物体系发光强度(以RLU表示）的影响。得出每个单因素的最优条件，带人下一组条件优化试验，最终优化出最佳底145146物反应条件组合。1.3.5免疫反应条件优化试验分别采用2 5、50、7 5、10 0、150、2 0 0 L免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌，在最佳化学发光底物条件下进行上机检测优化最适免疫磁珠用量。将CLMEIA检测体系中的一抗与PBST按体积比1:2 0 0 0、1：4000、1:6 0 0 0、1:8 0 0 0 稀释进行优化试验。1.3.6牛奶样品检测取纯牛奶1mL,以12 0 0 0 r/min离心5min,弃上清液，除去牛奶中的脂肪,向其中加人1mL0.01 mol/LPBS缓冲溶液，涡旋混匀后以12000r/min离心2 min,弃上清液，重复2 次，再向其中加人1 mL 0.01 mol/L PBS缓冲溶液后,以12000r/min离心5min,取上清液1mL,用超纯水稀释至10 mL作为牛奶样液。将1mL2.5310、5.06104、2.5310 4CFU/mL 的鼠伤寒沙门氏菌菌体悬液以30 0 0 r/min离心5min后，弃上清液，向其中加入1mL牛奶样液，作为不同加标牛奶样品，应用CLMEIA法对加标牛奶样品鼠伤寒沙门氏菌进行测定；同时，对不添加菌体悬液的不同品牌牛奶进行实际样品测定。2结果与分析2.1化学发光底物体系优化由图1可知:RLU随着luminol 浓度的增加而增多，当luminol浓度在5.0 10-3mol/L时，相对标准偏差(RSD)较小,且RLU已能满足试验需要。为避免试剂浪费，故采用5.0 10-3mol/L为底物体系的最佳luminol浓度。3.0102.510%2.0101.510%1.010%5.010s05.010-72.010-34.010-36.010-38.01010.0103图1 luminol 浓度对RLU的影响由图2 可知：H,02作为本体系的反应底物可将luminol氧化成发光态，并被HRP高效催化。当H,0,浓度为1.7 6 10-mol/L时,RLU最多，且粮食与油脂RSD较好。故采用1.7 6 10-mol/L为底物体系的最佳H,0,浓度。9.010%7.510s6.0105nTd4.51053.01051.5108.810 1.010-2图 2、H,O,浓度对 RLU的影响由图3可知：当体系中不存在HRP时,RLU较少；当HRP质量浓度为5.0 10-smg/mL时,RLU最多。故采用5.0 10-5mg/mL为底物体系的最佳HRP质量浓度。2.4102.010%1.610%nT21.2108.0104.0105F01.010-62.510-555.010-5HRP质量浓度/（mg/mL)图3 HRP质量浓度对 RLU的影响在最佳底物体系条件下，即luminol5.010-3 mol/L、H,0,1.7 6 10 -mol/L 和 HRP 5.0 10-5 mg/mL,考察不同 PIP 浓度对 luminol-H,O2-HRP体系 RLU的影响,动力学反应监测总时间为180s。由图4可知：相比未加PIP的化学发光底物体系,PIP 增加了体系的 RLU,且随着 PIP 浓度的增加,RLU逐渐增大，当PIP浓度为1.0 10-mol/L时,RLU最多。由于在5.0 10 3mol/L处,RLU较多,且能满足试验的需要，从节省原料考虑，选择luminol浓度/（mol/L）5.010-3mol/L为底物体系的最优PIP浓度。同时luminol-H,O,-HRP-PIP化学发光体系为闪光型，发光反应启动后瞬间达到最大发光值，并在18 0 s内，衰减到较低的化学发光强度，故采用启动发光反应后(0 s)作为化学发光的检测时间。2023年第36 卷第11期3.010-25.510-2H,O,浓度/(mol/L)7.510-57.06.01021.010-42023年第36 卷第11期1.6x101.41071.21071.01070.81070.61070.41070.21070020406080100120140160 180时间/s图4PIP浓度对RLU的影响2.2免疫反应条件优化由图5可知：当采用2 0 0 L免疫磁珠用量时，由于磁珠的遮蔽作用，检测体系的化学发光信号降低,并且免疫磁珠用量增大也会增加非特异性吸附。当免疫磁珠用量为2 5L和50 L时,信噪比(S/N)接近,但当免疫磁珠用量为2 5 L时,阴性高,存在一定非特异性吸附,且RSD较大。综合考虑，选免疫磁珠用量50 L用于后续试验。3.510%阴性3.010%阳性S/N2.51002.010%1.5x101.010%0.5x10%025图5免疫磁珠用量对RLU的影响由图6 可知：最终选取RLU最多、RSD最小的2.510%2.010%TI1.51001.0100.510%01:2.000图 6 一抗体积稀释比对 RLU 的影响粮食与油脂11.010mol/L体积稀释比1：8 0 0 0 为反应体系的最佳一抗体积稀5.010mol/L1.0 x10mol/L5.010mol/L1.010mol/L5.0 x10mol/L1.010mol/L5.010-7mol/LV0mol/L816425075免疫磁珠用量/uL1:4 0001:6 000 1:8 000一抗体积稀释比147释比。2.3CLMEIA方法建立2.3.1校准曲线的建立将光密度（OD6oo）在1.0 0 左右的鼠伤寒沙门氏菌悬液进行梯度稀释,按1.3.3”试验过程进行测定。在2.510 4 2.510 CFU/mL范围内,RLU与鼠伤寒沙门氏菌对数lgC 的线性方程为y=647596x-210,R?=0.9873,检出限为3.0 10 3CFU/mL。2.3.2特异性检测本试验所用抗体对其他食源性致病菌无交叉反应,进行特异性检测的4种致病菌均为2.510CFU/mL。由图7 可知:在鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测中,RLU 最多,与其他抗原种类相比,具有明显优势。表明本方法可用于对鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测。4.0103.510%3.0107102.510nTI2.010%1.5x101.010%0.510%0鼠伤寒金黄色单核增生大肠杆菌沙门氏菌葡萄球菌李斯特菌0 157:H7抗原种类100150空白200图7 鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测2.3.3加标牛奶样品检测由表1可知：方法的加标回收率为8 7.9 4%113.04%、R S D 为0.8%3.1%,表明本方法准确度较高、精密度较好，与微生物平板计数方法数据一致。表1加标牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌回收率的测定（n=3）鼠伤寒鼠伤寒沙门氏菌沙门氏菌样品平均RLU添加量/检测值/(CFU/mL)(CFU/mL)空白牛奶2.5310 62.142.0502.49 1065.06 1041 010 5204.45 1042.53 104886 0202.86 1041:100002.3.4实际牛奶样品检测由表2 可知：取6 种市售牛奶样品，按照2.3.3回收率/%RSD/%98.423.187.941.9113.040.8148样品前处理方法，进行实际牛奶样品检测，不同品牌牛奶的RLU与空白接近,结果显示为阴性,表明在 6种纯牛奶样品中未检出鼠伤寒沙门氏菌。表2 实际牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌检测样品名称平均RLU纯牛奶1#637 605纯牛奶2#575 240纯牛奶3#610.600纯牛奶4#601 175纯牛奶5#626 750纯牛奶6#622.700空白622.695注：ND为未检出。3结论本文以鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,利用免疫磁珠富集分离技术,采用luminol-H,O2-HRP-PIP化学发光体系，联合抗原-抗体特异性结合的免疫学方法，建立CLMEIA法定量检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的方法。结果表明：最佳发光条件为鲁米诺、H,02、对碘苯酚的浓度分别为5.0 10-3、1.7 6 10-、5.0 10-3mol/L，辣根过氧化物酶的质量浓度为5.010-mg/mL;最佳免疫条件为免疫磁珠用量50L、一抗体积稀释比1:8 0 0 0;该方法的检出限为3.0103CFU/mL,加标回收率为8 7.9 4%113.04%。本方法操作简单、无需增菌处理、对环境要求不高、检测时间短，有望发展为新型化学发光磁酶免疫试剂盒产品,应用于原料牛奶中食源性致病菌检测研究。参考文献 1 ZHENG S,YANG X S,ZHANG B,et al.Sensitive detec-tion of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella typhimuri-um in food samples using two-channel fluorescence lateralflow assay with liquid Si quantum dot J.Food Chemis-try,2021,363:130400.2 TAROKH A,PEBDENI A B,OTHMAN H O,et al.Sensi-粮食与油脂tive colorimetric aptasensor based on g-C,N,Cu,O com-posites for detection of Salmonella typhimurium in food andwater J.Microchimica Acta,2021,188(3):87.3 MA X Y,LIN X C,XU X M,et al.Fabrication of gold/sil-ver nanodimer SERS probes for the simultaneous detection of检测结果Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus J.NDMicrochimica Acta,2021,188(6):202.ND 4 Q U INT E R O-CA M PO S P,JU A R E Z M J,M O R A IS S,e tNDal.Multiparametric highly sensitive chemiluminescenceNDimmunoassay for quantification of-lactam-specific immu-NDnoglobulin E J.Analytical Chemistry,2020,92(21):ND14608-14615.5 CAO J T,ZHAO L Z,ZHANG W S,et al.EngineeringWS2-Au-HRP assisted-multiple signal amplification strate-gy for chemiluminescence immunoassay of prostate specificantigen J.New Journal of Chemistry,2021,45(28):12494 12499.6 ZONG C,JIANG F,WANG X Y,et al.Imaging sensorarray coupled with dual-signal amplification strategy for ul-trasensitive chemiluminescence immunoassay of multiplemycotoxins J.Biosensors and Bioelectronics,2021,177:112998.7 ZHANG B,LI H Z,LI Y,et al.A sensitive chemilumi-nescence immunoassay based on immunomagnetic beads forquantitative detection of zearalenone J.European FoodResearch and Technology,2021,247:2171-2181.【8 蒋艳，余姓鸿，谢礼，等化学发光免疫方法在食品安全检测中的应用及展望 J食品安全质量检测学报,2020,11(20):7603-7609.9 LIJ W,LIU Q J,WAN Y P,et al.Rapid detection oftrace Salmonella in milk and chicken by immunomagneticseparation in combination with a chemiluminescence mi-croparticle immunoassay J.Analytical and BioanalyticalChemistry,2019,411(23):6067-6080.10王玲，管笛，周欣，等。磁性化学发光酶免疫法检测猪肉中的氯霉素 J食品科学，2 0 17，38(10)：30 5-30 9.【11】范龙兴，宁保安，孙智勇，等.基于化学发光磁酶免疫分析技术检测单增李斯特菌 J：食品研究与开发,2017,38(3):124 129.2023年第36 卷第11期