DB37∕T 4052—2020 小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范(山东省).pdf

TCS 11.220 B 41 DB37 山东省山巳ET且，万标准DB37/T 4052-2020 小反鱼兽疫恒温扩增检测技术规范Technical specification for isothermal amplification ofPeste des petits ruminants 2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准白山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准白山东省畜牧业标准化技术委员会归口。DB37/T 4052-2020 本标准起草单位:山东师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生物科技有限公司、桂林市l临桂区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:陈营、于小文粤、吴晓东、陈艳如、廖炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。I DB37/T 4052-2020 小反色兽疫恒温扩增检测技术规范1 范围本标准规定了小反生兽疫(PPR)的恒温核酸扩增检测技术的要求。本标准适用于小反生兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489-2008实验室生物安全通用要求NY/T 541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 原理核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，再依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下扩增。4 试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。在1水:符合GB/T6682中规定的一级水。4.2 1 XPBS 溶液(pH值7.4)配制见附录A.1o4.3 核酸提取试剂:a)Trizol;b)氯仿;c)75%乙醇;d)异丙醇。4.4 恒温扩增试剂盒。4.5 不含RNA酶的水DEPC处理过的不含RNA酶的水。4.6 恒温扩增检测号|物:恒温扩增检测号|物表B.1o4.7 无水乙醇04.8 做量移液器配套的带滤芯吸头。4.9 离心管1.5 mL 5 材料及设备DB37/T 4052-2020 主要仪器设备:a)微量移液器10jl L、20L、100L、1000L;b)高速台式离心机:离心力二三8000 g;c)生物安全柜;d)冰箱;e)涡旋振荡器;f)研磨管;g)荧光定量PCR仪:h)天平:感量为0.001go 6样品6.1 基本要求应符合GB19489-2008和NY/T541-2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。6.2 样品采集6.2.1 棉揽子样品无菌采集羊口鼻棉拭子。6.2.2 组织样晶无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。2C8 C低温运至实验室用于检6.2.3 环境样品采集与病羊相关场所的粪便、饲料、污水样品。2C8 C低温运至实验室。6.3 样品处理方法6.3.1 口鼻揽子样品处理口鼻拭于管6000 g震荡45秒，取200jl L进行核酸提取。6.3.2 淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理取0.0.5g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000 g震荡研磨45秒，制成约10%的组织匀浆液，5 000 g离心5min，取200L上清液进行核酸提取。6.3.3 粪便、饲料样品处理取1g的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g/min震荡研磨45秒，制成约10%的匀浆液，5 000 g/min离心5mi口，取200L上清液进行核酸提取。6.3.4 污水样品处理取200jl L污水进行核酸提取。2 DB37/T 4052-2020 7 操作步骤7.1 RNA的;是Ij:-Tr i zo I 5去7.1.1 取6.2处理后的样品向处理好的3001.1 L组织样品或血清中加入800LTrizol，重复吹打以裂解细胞(或者剧烈振荡)，冰上放置10min25 mino 7.1.2 加入氯仿200L，用力振荡30s，室温放置5mino 7.1.3 4 oc,8 000 g离心15min，吸取上层液体500L于1.5 mL离心管中。7.1.4 加入1.0 mL异丙醇，-20 oc沉淀RNA至少1h。7.1.5 4 oC 8 000 g离心10min，弃上洁，用75%的乙醇洗涤沉淀，8 000 g离L，5 min，彻底弃去上洁，自然条件下干燥沉淀，溶于50LDEPC处理的灭菌水中，-20 oC贮存，备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。7.2 恒温核酸扩增设501.IL恒温核酸扩增反应体系，详见附录B.2。7.3 检测每次反应设置阳性、阴性对照，具体反应程序见表B.3。8 结果要IJ定8.1 结果判读见表10表1结果要IJ定序号通道Ct值结果判断I F剧UNDET或40样本低于检测限，报告为阴性2 FAM 芝三37判定为阳性3 FAM 37-40 复检一次，如仍为37-40，则判定为阴性8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。8.3 结果参考图谱:见附录C。3 1 XPBS容液(pH直7.4):a)磷酸二氢饵(K比PO.j):O.27 g;b)磷酸氢二铀(NaPO.j):1.42 g;c)氧化铀(NaCl):8 g;d)氧化伺(KCl):0.2 g。附录A(规范性附录)试剂的自己制DB37/T 4052-2020 加灭菌水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后走容到1L 4 DB37/T 4052-2020 附录B(规范性附录)恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件B.1 恒温核酸扩增引物见表B.1o表B.1 恒温核酸扩增引物号|物序列PRRV-F 5-ATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTTTATA-3 PRRV-R 5一TCCACATCGCTGTCGTCAGATCCATCCTCTCCT-3 5-GTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGAC(FAM-d T)(THF)(BHQ1-d T)CTCGTGGTTCAAGCA-C3 spacer PRRV-Probe 3 注F为FAM荧光基团标记、T为THF、B为BHQ1粹灭基团标记、3末端为C3Spacer标记。B.2 恒温核酸扩增体系见表B.20 表B.2 恒温核酸扩增体系组分用量L DEPC水25.4 A Buffer 12.5 10 Jl M PRRV-F 2 10M PRRV-R 2 10 JlM PRRV-Probe o.6 模板RNA5 B Buffer 2.5 涡旋混合并离心上述溶液，装有干粉的反应管用移液器上下吹打直至干粉溶解完全并混合均匀。5 B.3 恒温核酸扩增反应条件见表B.3。反应温度循环数信号采集反应时间表B.3 恒温核酸扩增反应条件DB37/T 4052-2020 反应条件39 oc 40 每30s 20 min 6 DB37/T 4052-2020 附录(资料性附录)小反鱼兽疫恒温扩增检测结果要IJ卖c Amplification Plot 阴性对照和阳性对照见图C.1o曲曲惆刨阳旧制副-Negative-Posi位V巳4四川05O.oo0 E隅.0004 250;田。E四.000150;田。100,000 50;咽。55 50.40,.JO Cycle 忌。15，。阴性对照和阳性对照图C.1 样品检测见图C.20-PT仨NTC-Sorrct!-知咱时阳可池，眨曲。n刷刷唰日X用vr52丛。I!-r-。0800 仁吧I，:悍，Y町晴陆mml$)阳02 4xl 样品中金泪IJ图C.2 7