环境相关浓度EHDPP长期暴露对斑马鱼的甲状腺内分泌干扰效应.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 4 期 2023 年 8 月Vol.18,No.4 Aug.2023 基金项目:农业农村部淡水渔业健康重点实验室开放课题(ZJK202010);中央高校基本科研业务费专项资金(2662021SCPY003)第一作者:舒燕(1996),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:#共同通信作者(Co-corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230302001舒燕,于梓辰,李涛,等.环境相关浓度 EHDPP 长期暴露对斑马鱼的甲状腺内分泌干扰效应J.生态毒理学报,2023,18(4):279-292Shu Y,Yu Z C,Li T,et al.Thyroid endocrine disruption of EHDPP at environmentally relevant concentrations on zebrafish(Danio rerio)J.Asian Jour-?nal of Ecotoxicology,2023,18(4):279-292(in Chinese)环境相关浓度 EHDPP 长期暴露对斑马鱼的甲状腺内分泌干扰效应舒燕1,于梓辰1,李涛1,岳喜凯1,原居林2,#,余丽琴1,*1.华中农业大学水产学院,武汉 4300702.浙江省淡水水产研究所农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室,湖州 313000收稿日期:2023-03-02 录用日期:2023-04-28摘要:作为一种典型的芳基有机磷阻燃剂,2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP)在各种水生环境和水生生物中有着较高检出率。体外实验表明 EHDPP 可能通过影响甲状腺激素(thyroid hormones,TH)与转运蛋白结合进而扰乱甲状腺内分泌系统。然而目前尚未有体内实验报道其甲状腺内分泌干扰效应及可能机制。本研究中,斑马鱼胚胎(2 hours post-fertilization,2hpf)暴露在环境相关浓度(0、1 和 10 g L-1)EHDPP 中 120 d,并收集 F1 代胚胎于清水中培养至 120hpf。研究结果表明,在 F0 代,EHDPP 暴露显著降低成鱼存活率、体质量、肝体质常数(hepatosomatic index,HSI)和性腺体质常数(gonadosomatic index,GSI)。进一步分析发现,EHDPP 显著降低雌鱼(10 g L-1EHDPP 暴露组)和雄鱼(1 g L-1EHDPP 暴露组)血清中甲状腺素(thyroxin,T4)水平,这可能在一定程度上抑制成鱼的生长。雌鱼 T4 水平降低伴随着促肾上腺皮质激素释放激素基因(corticotropin-releasing hormone,crh)显著性下调和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因(uridine diphosphate glucu-?ronosyl transferase,ugt1ab)显著性上调。此外,甲状腺激素转运蛋白基因(transthyretin,ttr)在 1 g L-1和 10 g L-1暴露组显著?下调,表明 EHDPP 可能通过干扰甲状腺激素与甲状腺激素转运蛋白(transthyretin,TTR)结合从而影响甲状腺激素平衡。雄鱼中,甲状腺激素受体基因(thyroid receptor,tr 和 thyroid receptor,tr)显著下调表明较少的甲状腺激素发挥作用从而抑制雄?鱼生长。在 F1 代仔鱼中,亲代暴露于 1 g L-1和 10 g L-1EHDPP 分别导致三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronin,T3)和 T4 水平显著降低,表明母体传递的甲状腺内分泌干扰效应。F1 代仔鱼 TH 合成相关基因(thyroglobulin,tg)和早期甲状腺发育相关?基因(paired box 8,pax8)显著下调,可能是 TH 水平降低的部分原因。脱碘酶基因(deiodinase 1,dio1和 deiodinase 2,dio2)表达?显著上调,可能是 T4 水平降低的代偿反应。本研究首次在体内实验中证明环境相关浓度 EHDPP 具有潜在甲状腺内分泌干扰效应,并且这种效应可能传递给 F1 代仔鱼。关键词:2-乙基己基二苯基磷酸酯;斑马鱼;甲状腺内分泌干扰;传递毒性文章编号:1673-5897(2023)4-279-14 中图分类号:X171.5 文献标识码:AThyroid Endocrine Disruption of EHDPP at Environmentally RelevantConcentrations on Zebrafish(Danio rerio)Shu Yan1,Yu Zichen1,Li Tao1,Yue Xikai1,Yuan Julin2,#,Yu Liqin1,*1.College of Fisheries,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China2.Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Zhejiang Institute of Freshwater Fish-280 生态毒理学报第 18 卷eries,Huzhou 313000,ChinaReceived 2 March 2023 accepted 28 April 2023Abstract:As an aryl organophosphorus flame retardant,2-ethylhexyl diphenyl phosphate(EHDPP)has been wide-ly detected in various aquatic environments and organisms.Previousin vitrostudies have demonstrated that EHD-?PP can disturb the thyroid endocrine system by affecting the binding of thyroid hormone(TH)to transport proteins.However,noin vivostudies have reported the thyroid endocrine disruption effects of EHDPP and the possible un-?derlying mechanisms remain unknown.In this study,zebrafish(Danio rerio)embryos(2 hpf)were exposed to envi-?ronmentally relevant concentrations(0,1 and 10 gL-1)of EHDPP for 120 d,and the F1 generation embryoswere then collected and cultured in clear water to 120 hpf.In the F0 generation,exposure to EHDPP significantlyinhibited the survival rate,body weight,hepatosomatic index(HSI)and gonadosomatic index(GSI)in adult ze-brafish.Further analysis revealed that 10 g L-1and 1 g L-1EHDPP decreased serum thyroxin(T4)levels of fe-male and male zebrafish,respectively,which possibly contributed to the growth inhibition in adult zebrafish.Thedecrease of T4 levels in females was accompanied by significant down-regulation of the corticotropin-releasinghormone(crh)gene and up-regulation of the uridine diphosphate glucuronosyl transferase(ugt1ab)gene.In addi-?tion,the thyroid hormone transporter protein gene(transthyretin,ttr)was significantly downregulated in the 1 g L-1and 10 g L-1group,suggesting that EHDPP might affect the thyroid hormones through interfering the bind-ing of TH to TTR.In male zebrafish,the thyroid hormone receptor genes(thyroid receptor,tr and thyroid re-?ceptor,tr)were both downregulated,indicating less activities of TH,which could contribute to and resulte in thebody growth inhibition.In F1 larvae,parental exposure to 1 g L-1and 10 g L-1EHDPP resulted in significant-ly decreased triiodothyronine(T3)and T4 levels in the descendants,respectively,suggesting a maternal transfer ofthyroid endocrine disrupting effects by EHDPP.The expressions of TH synthesis(thyroglobulin,tg)and early thy-?roid development(paired box 8,pax8)related genes were significantly downregulated,which might partially be re-?sponsible for the reduced TH levels.The expressions of deiodinase genes(deiodinase 1,dio1and deiodinase 2,?dio2)were both significantly upregulated,which could possibly be a compensatory response to the decrease of T4levels.In conclusion,we for the first time demonstrated the potential thyroid disruption effect of EHDPP at envi-ronmentally relevant concentrationsin vivo,which effect could be transferred to F1 larvae.Keywords:2-ethylhexyl diphenyl phosphate;zebrafish;thyroid endocrine disruption;transfer toxicity 2-乙基己基磷酸二苯酯(2-ethylhexyl diphenylphosphate,EHDPP)是一种具有磷酸酯主链结构的有机磷阻燃剂,被广泛用于照相胶片、黏合剂、油漆、橡胶和食品包装等各种产品中1。作为聚合物的添加剂,EHDPP 不与产品化学结合,因此在产品制造、使用和处置过程中很容易释放到环境中2。由于EHDPP 的高消耗量和易从相关产品中释放,其在各种环境样本中普遍存在,例如水、空气、灰尘、沉积物、生物体、食物甚至人体中3-9。我国吉林省松花江的地表水中 EHDPP 浓度为 94 ngL-110。Liu等11和 Xing 等12对中国太湖地表水检测发现,EHDPP 检出率分别为 88%和 100%,平均浓度为1.9 ngL-1和 2.8 ngL-1。中国辽河表层沉积物中EHDPP 检出率为 100%,浓度为 3.35 ng g-1(以单位干质量计),且是引起该地区生态风险的主要贡献者6。瑞典野生鱼类中 EHDPP 浓度高达14 000 ng g-1(以单位脂质量计)13。我国北京市 50 名孕妇的蜕膜和绒毛膜样品中,EHDPP 检出率分别为 100%与96%,平均浓度分别为18.0 ng g-1(以单位干质量计)和 44.4 ng g-1(以单位干质量计)14。毒理学研究表明,EHDPP 暴露会在各种生物体或细胞系中引起神经毒性15-16、生殖毒性17-18及内分泌干扰效应19-20。最近,体外研究发现 EHDPP 可能通过干扰甲状腺激素与转运蛋白结合影响甲状腺激素稳态。Zhao 等21使用荧光分析法发现 EHDPP和甲状腺激素转运蛋白有明显结合能力(IC50为8 340 nmol L-1);另有研究表明,0.1、1 和 10 molL-1EHDPP 暴露鸡胚肝细胞 36 h,甲状腺激素转运第 4 期舒燕等:环境相关浓度 EHDPP 长期暴露对斑马鱼的甲状腺内分泌干扰效应281 蛋白基因(transthyretin,ttr)浓度依赖式显著下调14。?此外,环境中检出率较高的其他有机磷阻燃剂,如磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCPP)22、磷酸三苯酯(triphenyl phos-phate,TPHP)23、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(tris(2-bu-toxyethyl)phosphate,TBOEP)24、磷酸三(2-氯丙基)酯(tris(1-chloro-2-propyl)phosphate,TCIPP)25已被证实会抑制斑马鱼生长,干扰甲状腺激素生成,引起甲状腺功能紊乱,具有内分泌干扰效应。但是目前还没有 EHDPP 对甲状腺激素影响的体内研究。此外,大量研究报道了母源性 EHDPP 暴露会导致子代发育毒性。如雌性日本青鳉暴露于环境浓度EHDPP(405 ng L-1和 1 161 ng L-1)后,在子代胚胎中检测出高于母体肝、脑、肌肉和卵巢组织的 EHD-PP 含量,并且子代仔鱼眼部发育异常26。Yan 等27研究发现围产期小鼠灌喂 EHDPP(300 g kg-1 d-1)导致子代雄性体质量下降、糖耐量紊乱,梭菌丰度增加,糖脂代谢通路相关基因下调。然而,甲状腺功能紊乱是否可以通过母体 EHDPP 暴露转移到后代仍不清楚。甲状腺激素(thyroid hormones,TH)包括 2 种形式,甲状腺素(thyroxin,T4)和具有生物活性的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronin,T3),其是影响多种生理过程的关键激素,包括神经发育、代谢、生殖、体温调节、心脏功能和组织修复28。在鱼类中,垂体分泌的促甲状腺激素(hyroid-stimulating hormone,TSH)刺激甲状腺激素的合成和释放,TSH 主要由下丘脑通过促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-relea-sing hormone,CRH)调控29。下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamic-pituitary-thyroid,HPT)轴的一些重要基因调控着甲状腺激素分泌、合成、转运、代谢和循环30。甲状腺激素的生物合成主要发生在甲状腺滤泡细胞中,在 TSH 的刺激下,甲状腺滤泡上皮细胞膜上的钠碘转运体(sodium/iodide symporter,NIS)从血液中摄取 I-,继而 I-被甲状腺过氧化物酶(thyroidperoxidase,TPO)氧化成活性碘;在甲状腺滤泡腔中,活性碘与甲状腺球蛋白(thyroglobulin,TG)酪氨酸残基结合后通过缩合反应形成 T3 和 T4;进入血液的T3 和 T4 经甲状腺激素转运蛋白运送至外周组织;在外周组织中,T4 在脱碘酶(deiodinase 1,DIO1 和deiodinase 2,DIO2)外环脱碘作用下转换成更具活性的 T3;T3 与甲状腺激素受体(hyroid receptor,TR 和 thyroid receptor,TR)结合,激活相应的生物学效应;除脱碘酶转化代谢外,甲状腺激素还可以在肝脏中通过硫酸化和葡萄糖醛酸化被降解31。本研究中,将斑马鱼从卵裂期(2 hpf)至120 d 暴露于环境相关浓度(0、1 和 10 g L-1)EHDPP,通过检测亲代斑马鱼(F0)血清中 TH 水平和 HPT 轴基因表达情况,以及 F1 代仔鱼体内 TH 水平和 HPT 轴相关基因表达情况,初步探究了环境浓度 EHDPP长期暴露对成鱼甲状腺内分泌干扰效应及传递毒性。研究结果为全面评估 EHDPP 的甲状腺内分泌干扰效应提供了理论依据,对其他有机磷阻燃剂导致甲状腺激素紊乱的机制研究也有参考意义。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 实验材料2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)纯度90%,购自梯希爱化成工业发展有限公司(上海,中国)。用于稀释和储备 EHDPP 的二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)纯度99%,购自 Sigma-Aldrich 公司(密苏里州圣路易斯,美国)。Trizol 试剂、Prime-ScriPtRT reagent 试剂盒、SYBRReal-Time PCRMaster 购自 Takara 公司(大连,中国)。甲状腺素(T4)检测试剂盒和三碘甲状腺原氨酸(T3)检测试剂盒购自武汉云克隆科技有限公司(武汉,中国),基因引物购自中国上海生工公司(上海,中国),丰年虫购自中国天津红太阳水产养殖股份有限公司(天津,中国),其他化学试剂均为分析纯级别。1.2 斑马鱼的饲养及暴露实验实验过程符合斑马鱼的伦理规范,按照丁希胜等32的方法进行标准饲养和暴露实验。斑马鱼胚胎(野生型 AB 品系)购于国家斑马鱼中心。基于之前的研究,5 gL-1EHDPP 暴露成年斑马鱼 21 d 对生长没有产生显著影响33,选择同一数量级的 1 g L-1作为 EHDPP 最低暴露浓度。选取发育正常的卵裂期胚胎(2 hpf),随机分配至含有 0、1 和 10 gL-1EHDPP 暴露液的培养皿中,每个皿放置 100 枚胚胎,每个浓度设置 3 个平行,所有暴露组 DMSO浓度为 0.001%(V/V)。将培养皿置于光照培养箱?中,5 d 后将孵化出的仔鱼转移到25 L 的鱼缸内,每24 h 全部更换一次暴露液。光暗周期为 14 h 10h,水温稳定在(280.5),每日投喂 2 次丰年虫。暴露120 d 后,随机选择4 尾雌鱼,4 尾雄鱼,以1 1 的比例将其混在一起产卵,将发育正常的胚胎转移到直径90 mm 的培养皿中,每个培养皿放置50枚胚胎,清水培养至 120 hpf。每天清理卵膜及死掉282 生态毒理学报第 18 卷的胚胎,统计 120 hpf 存活率,每个浓度随机选取 30尾仔鱼分别在 72 hpf 和 120 hpf 统计心率和体长。测量成鱼体长、体质量后,用 0.03%间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(0.03%MS-222)将其麻醉,断尾取血,收集血清检测甲状腺激素;解剖斑马鱼取组织样品(脑、肝和性腺),称量质量计算脑体质常数(brainsize index,BSI)、肝体质常数(hepatosomatic index,HSI)和性腺体质常数(gonadosomatic index,GSI)。1.3 成鱼和仔鱼甲状腺激素的检测暴露结束后,收集成鱼的血于 200 L 离心管中,静置 5 min 后置于离心机,5 000g,离心 5 min,?同一性别 5 尾鱼的血清合计 10 L 为一个样品,-80 保存。收集 200 尾仔鱼作为一个平行样本,每个样本加入 0.25 mL 的样品稀释液后用组织匀浆破碎仪匀浆。冰上超声破碎 5 min,随后 4,5 000g,离心 10 min,取上清于-80 备用。成鱼血清?和仔鱼体内甲状腺激素的检测严格按照酶联免疫吸附试验法(ELISA)说明书进行操作。T3 和 T4 的检测限分别为 50.5 pgmL-1和 1.29 ngmL-1,组内和组间检测变异系数分别低于 10%和 12%。1.4 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)斑马鱼暴露 120 d 后,收集 F0 代肝脏、脑(包括下丘脑和垂体)(同一性别 3 个肝脏或脑作为 1 个样本)和 F1 代仔鱼(30 尾作为一个样本)测定基因表达,每个样本 3 个重复。RNA 提取、纯化、cDNA 合成,实时荧光定量 PCR 以及引物序列等参考试剂盒说明书和 Yu 等34的文章,引物序列见表 1。1.5 数据处理与分析所有实验组设置 3 个平行,数据分析使用 SPSSStatistics 20.0 软件(IBM CorP.,Armonk,NY,USA)。实验数据分别使用 Kolmogorov-Smirnov 和 Levenes检验方法进行正态分布检验和方差齐性检验。通过单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANO-VA)评估对照组和实验组间的差异,采用 Tukeys比较法后检验,数据表示为平均值标准误(MeanSEM),P0.05 为显著性差异。2 结果(Results)2.1 F0 代和 F1 代生长发育终点指标EHDPP 暴露 120 d 对 F0 代孵化率和存活率的影响如表 2 所示。与对照组相比,10 gL-1EHD-PP 暴露组孵化率显著降低8.84%(P0.05)。在1 g L-1和 10 g L-1EHDPP 暴露组,存活率相较于对照组分别显著降低 15.04%和 19.91%(P0.05,P?0.01)。EHDPP 对斑马鱼成鱼生长发育的影响如表 3所示。与对照组相比,雌鱼体长无显著变化,10 g L-1EHDPP 暴露组雄鱼体长显著降低 6.68%(P?0.05);雌鱼体质量在 10 g L-1EHDPP 暴露组显著下降 21.21%(P0.05),雄鱼体质量在 1 g L-1和 10?g L-1EHDPP 暴露组分别显著降低 20.59%和26.47%(P0.05,P0.01)。在雌鱼中,与对照组相比,表 1 下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴相关基因的引物序列信息Table 1 Primers sequences for tested genes along hypothalamic-pituitary-thyroid(HPT)axis基因名称Gene name正义链序列(5 3)Sense strand(5 3)反义链序列(5 3)Antisense strand(5 3)基因登录号Gene IDgapdhCTGGTGACCCGTGCTGCTTTTTGCCGCCTTCTGCCTTANM_001115114tgCCAGCCGAAAGGATAGAGTTGATACTGCCGTGGAATAGGAXM_001335283nisGGTGGCATGAAGGCTGTAATGATACGGGATCCATTGTTGGNM_001089391crhTTCGGGAAGTAACCACAAGCCTGCACTCTATTCGCCTTCCNM_001007379tshGCAGATCCTCACTTCACCTACCGCACAGGTTTGGAGCATCTCAAY135147nkx2.1AGGACGGTAAACCGTGTCAGCACCATGCTGCTCGTGTACTNM_131589pax8GAAGATCGCGGAGTACAAGCCTGCACTTTAGTGCGGATGAAF072549trCTATGAACAGCACATCCGACAAGAGCACACCACACACGGCTCATCNM_131396trTGGGAGATGATACGGGTTGTATAGGTGCCGATCCAATGTCNM_131340ttrCGGGTGGAGTTTGACACTTTGCTCAGAAGGAGAGCCAGTABC081488dio1GTTCAAACAGCTTGTCAAGGACTAGCAAGCCTCTCCTCCAAGTTBC076008dio2GCATAGGCAGTCGCTCATTTTGTGGTCTCTCATCCAACCANM_212789ugt1abCCACCAAGTCTTTCCGTGTTGCAGTCCTTCACAGGCTTTCNM_213422第 4 期舒燕等:环境相关浓度 EHDPP 长期暴露对斑马鱼的甲状腺内分泌干扰效应283 BSI 无显著变化,HSI 和 GSI 在 10 gL-1EHDPP暴露组显著降低(20.00%和 33.97%)(P0.05,P?0.01)。在雄鱼中,与对照组相比,BSI 在 1 g L-1和10 g L-1EHDPP 暴露组分别显著降低 16.81%和18.14%(P0.05,P0.05),HSI 在 1 g L-1和 10 g?L-1EHDPP 暴露组分别显著降低 29.89%和 38.04%(P0.05,P0.05),GSI 在 1 gL-1和 10 gL-1?EHDPP 暴露组分别显著降低 37.39%和 48.70%(P?0.01,P0.01)。EHDPP 对 F1 代仔鱼生长发育的影响如表 4 所示,与对照组相比,F1 代仔鱼心率、体长和存活率无显著差异。2.2 F0 代和 F1 代甲状腺激素含量变化如表5 所示,在 F0 代斑马鱼中,与对照组相比,雌鱼血清中总 T4 水平在 10 g L-1EHDPP 暴露组显著降低 22.30%(P0.05),雄鱼血清中总 T4 水平?在 1 gL-1EHDPP 暴露组显著降低 34.31%(P?0.05);雌鱼、雄鱼血清中总 T3 水平相较于对照组均无显著差异。F1 代仔鱼中,10 g L-1EHDPP 亲代暴露组总 T4 水平与对照组相比显著降低 37.52%(P0.05),1 gL-1EHDPP 亲代暴露组总 T3 水平与?对照组相比显著降低 16.57%(P0.05)。表 2 0、1、10 g L-12-乙基己基磷酸二苯酯(EHDPP)暴露 120 d F0 代斑马鱼孵化率和存活率Table 2 Hatching rate and survival rate in F0 zebrafish exposed to 0,1 and 10 g L-12-ethylhexyldiphenyl phosphate(EHDPP)for 120 d0 g L-11 g L-110 g L-1孵化率(72 h)/%Hatching rate(72 h)/%98.170.5196.750.6389.494.26*存活率/%Survival rate/%75.330.0264.000.02*60.330.01*注:每个浓度 3 个平行,每个平行 100 枚胚胎;实验数据以平均值标准误表示(meanSEM);*表示暴露组与对照组之间具有显著性差异(*P?0.05、*P0.01)。Note:There were three replicates and each group contained 100 embryos;experimental data expressed as meanstandard error of mean(meanSEM);as-terisk indicated significant difference between exposed group and control group(*P0.05,*P0.01).表 3 EHDPP(0、1、10 g L-1)暴露 120 d 对 F0 代斑马鱼体质指数的影响Table 3 Somatic indices in F0 zebrafish after exposure to EHDPP(0,1,10 g L-1)for 120 d雌鱼Female雄鱼Male0 g L-11 g L-110 g L-10 g L-11 g L-110 g L-1体长/mmBody length/mm26.550.4925.790.9225.290.5527.620.3826.390.3425.890.67*体质量/gBody weight/g0.330.020.310.010.260.02*0.340.020.270.01*0.250.02*脑体质常数(BSI)/%Brain size index(BSI)/%2.060.131.890.091.950.102.260.111.880.10*1.850.17*肝体质常数(HSI)/%Hepatosomatic index(HSI)/%3.600.163.040.292.880.16*1.840.291.290.17*1.140.01*性腺体质常(GSI)/%Gonadosomatic index(GSI)/%12.041.0211.520.997.950.60*2.300.141.440.06*1.180.15*注:BSI=100%脑质量/体质量,HSI=100%肝脏质量/体质量,GSI=100%性腺质量/体质量;每个浓度 3 个平行,每个平行至少 10 个数据;实验数据以平均值标准误表示(meanSEM);*表示暴露组与对照组之间具有显著性差异(*P0.05、*P0.01、*P0.001)。Note:BSI=100%brain weight/body weight,HSI=100%liver weight/body weight,GSI=100%gonad weight/body weight;three replicates per con-centration,with at least 10 data per replicates;experimental data expressed as meanstandard error of mean(meanSEM);asterisk indicated significantdifference between exposed group and control group(*P0.05,*P0.01,*P0.001).284 生态毒理学报第 18 卷表 4 母源性 EHDPP(0、1、10 g L-1)暴露 120 d 对 F1 代仔鱼心率、体长和存活率的影响Table 4 Heart rate,body length and survival rate in F1 larvae derived fromparental exposure to EHDPP(0,1,10 g L-1)for 120 d0 g L-11 g L-110 g L-1心率/(次 (15 s)-1)Heart rate/(brats (15 s)-1)47.380.2046.920.8747.130.27体长/mmBody length/mm3.860.013.810.043.830.04存活率/%Survival rate/%84.670.0388.000.0378.000.02注:每个浓度 3 个平行,心率与体长每个平行 10 尾鱼数据,存活率每个平行共 50 尾仔鱼;实验数据以平均值标准误表示(meanSEM)。Note:Three replicates per concentration,10 larvae per replicate for heart rate and body length,and a total of 50 larvae per replicate for survival rate;ex-perimental data expressed as meanstandard error of mean(meanSEM).表 5 EHDPP(0、1、10 g L-1)暴露 120 d 对 F0 成年斑马鱼和未暴露 F1 代仔鱼总甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)水平的影响Table 5 Total thyroxine(T4)and triiodothyronin(T3)levels in F0 adult zebrafish after exposed toEHDPP(0,1,10 g L-1)for 120 d and in the F1 larvae derived from parental zebrafish exposed to EHDPP斑马鱼Zebrafish甲状腺激素(TH)水平Thyroid hormones(TH)levels性别SexEHDPP/(g L-1)0110F0T4T3雌鱼Female11.741.169.390.399.120.04*雄鱼Male17.953.0811.790.61*13.602.73雌鱼Female0.190.000.200.010.200.01雄鱼Male0.220.020.200.000.200.01F1(-EHDPP)T462.478.8648.522.7339.003.29*T30.270.010.230.01*0.250.02注:T4 和 T3 水平单位为 ng mL-1;对于成年斑马鱼,同一性别 5 尾鱼的血清为一个样本,每个浓度 3 个平行;对于 F1 代仔鱼,200 尾仔鱼为一个样本,每个浓度 3 个平行;每个样本做 2 个技术重复;实验数据以平均值标准误表示(meanSEM);*表示暴露组与对照组之间具有显著性差异(*P0.05)。Note:The T4 and T3 levels were expressed as ng mL-1;for the adult zebrafish,serum samples from five individual fish were pooled and measured with 3replicates;for the F1 generation,200 larvae were measured with 3 replicates;two technique duplications were performed for each sample;experimental dataexpressed as meanstandard error of mean(meanSEM);asterisk indicated significant difference between exposed group and control group(*P0.05).2.3 F0 代和 F1 代 HPT 轴基因表达量如图 1(a)所示,在雌鱼脑中,与对照组相比,crh基因在 1 gL-1和 10 gL-1EHDPP 暴露组显著?下调,分别下调3.77 倍和7.58 倍;tsh 基因在10 g L-1EHDPP 暴露组显著上调(2.33 倍)。如图 1(b)所示,在雄鱼脑中,crh基因和tsh 基因表达水平相较?