实验一-革兰染色法.ppt

1微生物实验课注意事项微生物实验课注意事项禁止禁止不穿白大衣进入实验室；禁止禁止在实验室内吃东西、吸烟；不得高声喧哗，随 处走动；严禁严禁用酒精灯点燃酒精灯；严禁严禁把实验室内任何物品带出室外；病原材料病原材料污染桌面、地板等或误吸入口，应立即报告教师进行处理；爱护实验仪器设备，损坏仪器要赔偿损坏仪器要赔偿；实验完毕，废弃物放入指定地点，桌面理清洁，洗手后方可离室。值日同学负责打扫实验室值日同学负责打扫实验室，并关好水电、门窗方可离开。.2实验一 革兰染色法1.1.掌握油镜的使用掌握油镜的使用掌握油镜的使用掌握油镜的使用2.2.熟悉革兰氏染色法原理、熟悉革兰氏染色法原理、熟悉革兰氏染色法原理、熟悉革兰氏染色法原理、步骤、结果、意义步骤、结果、意义步骤、结果、意义步骤、结果、意义3.3.掌握细菌的基本形态和特殊结构掌握细菌的基本形态和特殊结构掌握细菌的基本形态和特殊结构掌握细菌的基本形态和特殊结构实验目的要求实验目的要求.3细菌染色的方法细菌染色的方法单染法单染法:采用一种染料染色采用一种染料染色,只能观察细菌的形态只能观察细菌的形态和排列特征，不能观察细菌的染色特性和进行鉴和排列特征，不能观察细菌的染色特性和进行鉴别。别。复染法（鉴别染色）复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使染料进行先后染色，使不同种类不同种类的细菌、同种细的细菌同种细菌的菌的不同结构不同结构，分别，分别染上不同染上不同的颜色，以便鉴别的颜色，以便鉴别细菌。细菌。.4革兰染色法革兰染色法该染色法是丹麦细菌学家革兰于该染色法是丹麦细菌学家革兰于该染色法是丹麦细菌学家革兰于该染色法是丹麦细菌学家革兰于1884188418841884年创建的年创建的年创建的年创建的,至至至至今仍广泛应用用于细菌分类和鉴别今仍广泛应用用于细菌分类和鉴别今仍广泛应用用于细菌分类和鉴别今仍广泛应用用于细菌分类和鉴别.5革兰染色法的原理革兰染色法的原理渗透学说：与肽聚糖的结构有关渗透学说：与肽聚糖的结构有关渗透学说：与肽聚糖的结构有关渗透学说：与肽聚糖的结构有关 革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，酒精不易渗透，反而形成一道屏障，阻止染料向细脂质含量低，酒精不易渗透，反而形成一道屏障，阻止染料向细脂质含量低，酒精不易渗透，反而形成一道屏障，阻止染料向细脂质含量低，酒精不易渗透，反而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗出。胞外渗出。胞外渗出。胞外渗出。革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精易渗透进入细胞内，将染料脱出。易渗透进入细胞内，将染料脱出。易渗透进入细胞内，将染料脱出。易渗透进入细胞内，将染料脱出。化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关 革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结合形成更大碘结合形成更大碘结合形成更大碘结合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。的复合物，不易被酒精脱出。的复合物，不易被酒精脱出。的复合物，不易被酒精脱出。等电点学说：与细菌所带电荷有关等电点学说：与细菌所带电荷有关等电点学说：与细菌所带电荷有关等电点学说：与细菌所带电荷有关 革兰阳性菌等电点低（革兰阳性菌等电点低（革兰阳性菌等电点低（革兰阳性菌等电点低（pIpI）为）为）为）为2323，在中性或碱性环境中所，在中性或碱性环境中所，在中性或碱性环境中所，在中性或碱性环境中所 带负带负带负带负电荷多；革兰阴性菌电荷多；革兰阴性菌电荷多；革兰阴性菌电荷多；革兰阴性菌pIpI为为为为4545，所带负电荷少，影响结合染色的，所带负电荷少，影响结合染色的，所带负电荷少，影响结合染色的，所带负电荷少，影响结合染色的多少多少多少多少.6实验材料与方法实验材料与方法材料材料材料材料:菌种：菌种：菌种：菌种：葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（18-24h18-24h）牙垢牙垢牙垢牙垢 试剂：试剂：试剂：试剂：结晶紫染液、碘液结晶紫染液、碘液结晶紫染液、碘液结晶紫染液、碘液 95%95%酒精、稀释苯酚复红液酒精、稀释苯酚复红液酒精、稀释苯酚复红液酒精、稀释苯酚复红液其他：其他：其他：其他：玻片、接种环、酒精灯玻片、接种环、酒精灯玻片、接种环、酒精灯玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等无菌生理盐水、显微镜等.7染染色色标标本本检检查查基基本本程程序序涂片涂片涂片涂片干燥干燥干燥干燥固定固定固定固定染色染色染色染色镜检镜检镜检镜检.8初染初染1min结晶紫结晶紫媒染媒染1min碘液碘液脱色脱色15-20s复染复染1min复红复红/苯酚苯酚95%乙醇乙醇G+G-革兰氏染色步骤与现象革兰氏染色步骤与现象注意：每一步染色后水冲，甩干水每一步染色后水冲，甩干水.9(1)(1)(1)(1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。(2)(2)(2)(2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。(3)(3)(3)(3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。涂片观察（涂片观察（涂片观察（涂片观察（P3P3）P3P3.10注意事项注意事项1.1.1.1.革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。酒精脱色。如果脱色如果脱色如果脱色如果脱色过度过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。如果脱色时间如果脱色时间如果脱色时间如果脱色时间过短过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格界定。难以严格界定。难以严格界定。难以严格界定。2.2.2.2.染色过程中勿使染色液稀释染色过程中勿使染色液稀释。用水冲洗后，应吸去玻片上的用水冲洗后，应吸去玻片上的用水冲洗后，应吸去玻片上的用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3.3.3.3.选用幼龄的细菌。选用幼龄的细菌。选用培养选用培养选用培养选用培养16h-24h16h-24h16h-24h16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄菌龄的细菌为宜。若菌龄菌龄的细菌为宜。若菌龄菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。.11实验完毕后的处理：实验完毕后的处理：实验完毕后的处理：实验完毕后的处理：1.1.1.1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯（用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦将镜头擦2-3次。次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。次。2.2.2.2.镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。.12金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(10100)大肠杆菌大肠杆菌(10100)染色结果染色结果.13染色结果螺形菌Spiral bacterium.14革兰染色意义革兰染色意义鉴别细菌鉴别细菌选择抗菌药物选择抗菌药物研究细菌的致病性研究细菌的致病性.15选择抗菌药物选择抗菌药物常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌属主要是常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌肺炎链球菌、草绿色、草绿色链球菌、链球菌、肠球菌肠球菌等）、白喉杆菌、等）、白喉杆菌、炭疽杆菌炭疽杆菌、破伤风杆菌破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌床重要等病原菌革兰氏阳性菌通常对革兰氏阳性菌通常对青霉素类、第一（或第二）代头孢菌青霉素类、第一（或第二）代头孢菌素素等高度敏感等高度敏感，青霉素可为化脓性细菌感染可首选药物，青霉素可为化脓性细菌感染可首选药物。.16选择抗菌药物选择抗菌药物常见的革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（常见的革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾痢疾杆菌杆菌等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、菌等）、霍乱弧菌霍乱弧菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐，且大多菌株容易对抗菌药物耐药药 革兰氏阴性菌对革兰氏阴性菌对第三代头孢、第三代头孢、氨基糖苷类、抗假单胞菌氨基糖苷类、抗假单胞菌属的青霉素类、多粘菌素属的青霉素类、多粘菌素等高度敏感，对头霉素类和第等高度敏感，对头霉素类和第二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆菌有效，如肠道病、腹泻为常用药菌有效，如肠道病、腹泻为常用药。.17研究细菌的致病性研究细菌的致病性革兰阳性菌可产生革兰阳性菌可产生外毒素外毒素使人使人致病。致病。革兰阴性菌主要以革兰阴性菌主要以内毒素内毒素使人使人致病。（致病。（LPS作为作为G-菌内毒菌内毒素致病素致病）.18实验步骤实验步骤观看鞭毛、荚膜、芽孢的示范片观看鞭毛、荚膜、芽孢的示范片绘图、写实验报告绘图、写实验报告细菌的特殊结构形态观察细菌的特殊结构形态观察.19 细菌的特殊结构细菌的特殊结构芽胞芽胞(nuclear material ornucleoid)(nuclear material ornucleoid)枯草杆菌芽孢的观察枯草杆菌芽孢的观察芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境。.20 细菌的荚膜的观察细菌的荚膜的观察荚膜（荚膜（capsule)荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体.21细菌鞭毛的观察细菌鞭毛的观察鞭毛：运动，菌落形态。鞭毛：运动，菌落形态。.22本次实验课结束本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净请确保油镜头擦拭干净交作业，值日同学留下交作业，值日同学留下下周实验课（细菌的人工培养）下周实验课（细菌的人工培养）再见！再见！.