石榴贮藏期褐斑病防治的研究毕业论文.doc

西昌学院毕业论文 石榴贮藏期褐斑病防治的研究

毕 业 论 文

题 目：
石榴贮藏期褐斑病防治的研究
学 院：
轻化工程学院
专 业：
食品质量与安全
学生姓名：
李少华
学 号：
1104090037
年级：
2011级
指导教师：
姚 昕
完成时间：
2015年5月20日

目 录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
0 前言 1
1 材料和方法 2
1.1 材料 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 PDA培养基的制备和灭菌 2
1.2.2 分离纯化 2
1.2.3 病原菌的形态特征观察 3
1.2.4 病原菌的科赫氏法则鉴定 3
1.3 不同药剂对石榴果褐斑病的室内毒力测定 3
1.3.1 供试药剂 3
1.3.2 室内毒力初筛测定方法 3
1.3.3 室内毒力复筛测定方法 4
1.3.4 食品添加剂对石榴病害防治 4
1.4 数据处理 5
2 结果与分析 5
2.1 病原菌鉴定 5
2.1.1 症状观察 5
2.1.2 病原菌的培养性状及形态特征 5
2.1.3 病原菌科赫氏法则鉴定 6
2.2 不同防腐剂对病原菌的室内毒力测定与分析 6
2.2.1 不同食品添加剂对病原菌的初筛室内毒力测定 6
2.2.2 不同食品添加剂对病原菌的复筛室内毒力测定 7
2.2.3 3种食品添加剂对石榴贮藏期病害的防治效果 8
3 结论 9
参考文献 10
致谢 11
独撰声明 11

石榴贮藏期褐斑病防治的研究
摘 要：从石榴果实上分离纯化得到石榴褐斑病的病原菌，根据病害症状特点、培养性状、病原菌形态特征和致病性测定等方面鉴定。选择20种食品添加剂，对其进行室内毒力试验和浸果试验， 筛选出3种食品添加剂，对贮藏期石榴褐斑病的发生具有较好的抑制效果，分别是2-萘酚、脱氢乙酸钠和聚赖氨酸，其中抑制效果最好的是2-萘酚，EC50为33.5771mg/L，EC90为122.3162mg/L，防治效果为48.53%。
关键词：石榴 褐斑病 毒力测定 防治
Studies on Control of Pomegranate Brown Spot Disease in Storage Period
Abstract: One kind of fungus was isolated from brown spot disease of Pomegranate. According to determination of disease symptoms, incubation properties, morphological characteristics, the pathogen was identified .20 kinds of food additives are used for the indoor toxicity test and the dipping fruit test. 3 kinds of food additives had better inhibition effect for brown spot disease of pomegranate. They were 2-hydroxynaphthalen, sodium dehydroacetate and DP, respectively. The inhibition effect of 2-hydroxynaphthalene was best. Its EC50 was 33.577 1mg/L, EC90 was 122.3162 mg/L, and control effect was 48.53%.
Key words: pomegranate brown spot disease toxicity test control
0 前言
石榴亦称番石榴，是桃金娘科番石榴属的常绿灌木或小乔木。石榴全身是宝，含有帮助消化、增进食欲的石榴酸，还具有抑菌、抗病毒的作用，同时会使体内的寄生虫产生麻痹作用。石榴果实味甘、涩、性温，具有治疗急性胃肠炎、急慢性咽喉炎、声音嘶哑、痔疮疼痛、痢疾腹泻、小儿疳疾等医药用功能[1]。同时还含有丰富的果酸、单宁、果胶质、黄酮类及花色素等有巨大的营养保健作用的物质。所以，石榴能够成为馈赠亲友的佳品。
褐斑病是石榴主要的病害之一[2]。在贮藏期间褐斑病会使石榴果皮呈现不规则的病斑，籽粒也会呈现淡绿色或红色颗粒状，果实的肉质由微酸甜变成清苦味，而且果实易腐烂，失去商业价值[3,4]。
1 材料和方法
1.1 材料
选用会理青皮软籽石榴为试验材料。
1.2 试验方法
1.2.1 PDA培养基的制备和灭菌
马铃薯去皮，称取200g，煮至软烂，去浮沫，用纱布过滤，滤液中加入20g琼脂和20g葡萄糖，并迅速加热，搅拌混匀，待琼脂和葡萄糖完全溶解后，冷却，定容至1000mL，分装入三角瓶中，121℃灭菌20min，取出冷却后备用。
1.2.2 分离纯化
采用组织分离法[5]对病原菌进行分离。从石榴果表皮的病斑处取大小为3mm×3mm的组织块若干，75％酒精消毒5-10s，取出，用无菌水清洗3次，并用无菌滤纸吸干，将其接到PDA培养基上，26℃恒温培养，5d后挑取组织边缘长出的菌丝块转接到另一个PDA培养基上，此后再纯化3次，得到的菌株保存在PDA斜面上，4℃下保存。
1.2.3 病原菌的形态特征观察
将分离纯化得到的病原菌进行活化后，26℃恒温培养，观察其菌落形态特征并记录。取出一小块，在10×40倍显微镜下观察其形态特征，并记录。
1.2.4 病原菌的科赫氏法则鉴定
供试验的菌株26℃培养5d后，采用刺伤接种法将菌块接种到健康石榴果实上，将石榴果实用75%酒精进行表面消毒，然后用无菌水清洗3次，用灭菌的接种环针在果实表面刺孔，然后将直径约4mm的活化菌丝块接种于刺孔处，以接种空白培养基为对照，26℃保湿培养，定期观察发病情况。比较其发病症状与初次分离时的症状是否一致，并对接种成功的病斑进行组织分离，与接种的菌株相对比[6]。
1.3 不同药剂对石榴果褐斑病的室内毒力测定
1.3.1 供试药剂
试验选用20种食品添加剂[7]，见表1。
表1 供试药剂
商品名
有效成分及含量
药剂状态
商品名
有效成分及含量
药剂状态
艾玛斯特
2.5%乳酸
链球菌素
白色粉末状
KESHI
99.5%2-萘酚
粉白色片状
傲阳
98%脱氢乙酸钠
白色粉末状
KESHI
99%乙二胺四
乙酸二钠
白色粉末状
亿航化工
聚赖氨酸
淡黄色粉末状
展云
95%肉桂醛
浅黄色油状
绿茶萃取精华
98%茶多酚
红褐色粉末状
焦亚硫酸钠
97.5%焦亚
硫酸钠
白色晶体颗粒
EKESR
24-二氯苯
氧乙酸
白色粉末状
圣效
98.5%对羟基苯甲酸甲酯钠
白色结晶颗粒
尼泊金乙酯
99%对羟基苯
甲酸乙酯
白色晶体状
瑞林
单辛酸甘油酯
白色结晶固体
奥凯
58%双乙酸钠
白色晶体状
梅
丙酸钙
白色粉末状
银象
50%纳他霉素
灰色粉末状
仲丁胺
99%仲丁胺
白色结晶粉末
王龙
98%山梨酸钾
乳白色颗粒
万年桥牌
99.58%苯甲酸钠
白色粉末状
LUSEN
99%对羟基苯
甲酸乙酯钠
白色粉末状
秀霸
36%二氧化
氯消毒粉
白色粉状

1.3.2 室内毒力初筛测定方法
采用生长速率法对石榴病害进行食品添加剂室内毒力测定[8-10]，试验选择20种食品添加剂进行初步筛选，试验使用的药剂见表1。根据食品添加剂使用标准将2-萘酚配制成含药浓度为2、20、200mg/L的3个浓度梯度，将其它食品添加剂分别按照各自的药品有效成分配制成含药培养基浓度为20、200、2000mg/L。取已配制好的溶液1mL于培养皿中，迅速倒入9mL 50℃左右的PDA培养基，趁热摇匀，冷却，得到不同浓度含药培养基，每个处理3次重复，用无菌水作为对照。将直径约4mm的活化菌块接种到各培养基上，26℃恒温培养[6]，5d后，采用十字交叉法测量菌落直径(cm)，计算各种食品添加剂对石榴褐斑病原菌的抑制率，查生物统计机率值换算表得出机率值，初步筛选出抑制效果较好的几种添加剂。

1.3.3室内毒力复筛测定方法
将初筛选出来的6种食品添加剂配制成如表2所列浓度，以无菌水作为对照，方法同前。采用最小二乘法计算出各种食品添加剂的毒力回归方程[12]，然后进行相关性分析，求出EC50和EC90。
表2 6种食品添加剂浓度配制
药剂名称
含药浓度（mg/L）
对羟基苯甲酸乙酯
2
20
50
100
200
500
1000
聚赖氨酸
2
20
50
100
200
500
1000
2-萘酚
2
10
20
40
80
100
150
脱氢乙酸钠
20
50
100
150
200
500
1000
肉桂醛
50
100
160
200
400
800
1600
对羟基苯甲酸乙酯钠
50
100
160
200
400
800
1600
1.3.4 食品添加剂对石榴病害防治
将筛选出来的食品添加剂按照各自的抑菌率为90%对应的浓度( EC90)进行配制，以清水为对照，对石榴果实浸泡3min，20个果实为1个处理，每个处理进行3次重复，在26℃、相对湿度为85%-90%的条件下贮藏，对各处理果实进行编号以便调查。在贮藏5d后对病害展开调查，记录病害级别（见表3），计算出发病指数、发病率和防治效果[11-14]。

表3 病害级别表
病害级别
分级标准
病害级别
分级标准
0级
无病斑
3级
接种点坏死斑直径为1.0-2.0cm
1级
接种点坏死斑直径为0.5cm以下
4级
接种点坏死斑直径为2.0-4.0cm
2级
接种点坏死斑直径为0.5-1.0cm
5级
接种点坏死斑直径为4.0cm以上

1.4 数据处理
用Excel做数据统计与作图处理，并对所得图、表分析和讨论。
2 结果与分析
2.1 病原菌形态学鉴定
2.1.1 症状观察
石榴果皮初期病变部位为浅褐色，呈不规则的病斑形状，并不断向四周扩散，后期颜色逐渐加深变为黑褐色，病健交界处明显，且向内凹陷[15]（见图1左）。
2.1.2 病原菌的培养性状及形态特征
将褐斑病原菌接种到PDA培养基上，26℃恒温培养1d后，如图2观察可知，菌块周围长出白色气生菌丝[10]，然后又在平板表面逐渐呈近似圆形放射状扩展，培养5d后，菌落直径达到5.0-7.0cm（见图1中）。
显微镜下观察，4-5d后形成黑色的分生孢子器，分生孢子器簇生，形状类似球形，呈淡褐色，大小为(123.0-145.0)×(55.0-75.0)µm；顶端具圆形孔口，大小为12.5-15.0µm；分生孢子纺锤形，淡褐色，直或微弯，大小为(1014.5)×(2.5-3.5)µm（见图1右）。

图1 石榴果果皮受害症状（左）、PDA培养基上的菌落形态（中）和石榴褐斑病病菌形态（右）
2.1.3 病原菌科赫氏法则鉴定
刺伤接种的石榴果发病症状特点与自然发病石榴果症状基本相同，从发病组织分离的病原菌与自然发病组织分离的病原菌为同一种。
2.2 不同防腐剂对病原菌的室内毒力测定与分析
2.2.1 不同食品添加剂对病原菌的初筛室内毒力测定
选取20种食品添加剂分别按照各自的剂型以及含量配制成不同种的浓度梯度，并对纯化的菌株进行初步试验筛选，培养5d，采用十字交叉法测量菌落直径，实验结果见表4。20种食品添加剂初筛的试验结果表明，聚赖氨酸、对羟基苯甲酸乙酯、肉桂醛、对羟基苯甲酸乙酯钠、脱氢乙酸钠和2-萘酚这6种添加剂均对褐斑病有较好的抑制效果。
表4 20种不同浓度食品添加剂对石榴褐斑病原菌的室内毒力测定
药剂名称
药剂浓度(mg/L)
菌落平均直径（cm）
抑菌率(%)
机率值
药剂名称
药剂浓度(mg/L)
菌落平均直径（cm）
抑菌率(%)
机率值
2-萘酚
2
5.01
23.7
4.2840
二氧化氯消毒粉
20
6.26
4.7
3.3253
20
0.95
85.5
6.0581
200
5.89
10.4
3.7409

200
0.00
100.0
-
2000
5.52
16.0
4.0055
脱氢乙酸钠
20
6.42
2.3
3.0046
对羟基苯甲酸甲酯钠
20
5.98
9.0
3.6592
200
5.14
21.8
4.2210
200
4.25
35.3
4.6228
2000
1.76
73.2
5.6189
2000
3.67
44.1
4.8516

续表4-1

对羟基苯甲酸乙酯
20
5.78
12.0
3.8250
乙二胺四乙酸二钠
20
6.00
8.7
3.6405
200
2.35
64.2
5.3638
200
5.89
10.4
3.7409
2000
0.35
94.7
6.6164
2000
3.35
49.0
4.9749
聚赖氨酸
20
5.79
11.9
3.8200
2,4-二氯苯氧乙酸
20
5.99
8.8
3.6468
200
1.68
74.4
5.6557
200
4.90
25.4
4.3380
2000
0.00
100.0
-
2000

0.50
92.4
6.4325
对羟基苯甲酸乙酯钠
20
6.45
1.8
2.9031
焦亚硫酸钠
20
6.44
2.0
2.9463
200
2.92
55.6
5.1408
200
6.44
2.0
2.9463
2000
0.00
100.0
-
2000
4.30
34.6
4.6039
肉桂醛
20
6.39
2.7
3.0732
山梨酸钾
20
6.14
6.5
3.4859
200
5.16
21.5
4.2108
200
5.27
19.8
4.1512
2000

0.00
100.0
-
2000
2.28
65.3
5.3934
苯甲酸钠
20
6.47
1.5
2.8299
丙酸钙
20
6.50
1.1
2.7096
200
5.17
21.3
4.2039
200
6.45
1.8
2.9031
2000
3.85
41.4
4.7827
2000
6.35
3.4
3.1750
乳酸链球菌素
20
5.60
14.8
3.9550
双乙酸钠
20
6.54
0.5
2.4242
200
5.55
15.5
3.9848
200
6.19

5.8
3.4282
2000
5.45
17.0
4.0458
2000
3.80
42.2
4.8032
单辛酸甘油脂
20
5.74
12.6
3.8545
仲丁胺
20
6.56
0.2
2.1218
200
5.62
14.5
3.9419
200
6.29
4.3
3.2831
2000
4.89
25.6
4.3443
2000
3.23
50.8
5.0201
茶多酚
20
6.01
8.5
3.6278
纳他霉素
20
5.95
9.4
3.6835
200
5.90
102
3.7298
200
5.88
10.5
3.7464
2000
4.30
34.6
4.6039
2000
5.75
12.5
3.8497
空白
-
6.57
-
-

备注：菌落直径均为去除菌块直径后3次重复的平均值，机率值为查生物统计机率值换算表所得。
2.2.2 不同食品添加剂对病原菌的复筛室内毒力测定
通过对石榴果褐斑病原菌的室内毒力测定的初筛试验，得到6种抑菌效果较好的食品添加剂，进一步设定浓度，进行室内毒力复筛试验，试验结果见表5。
表5 6种不同浓度食品添加剂对石榴果褐斑病原菌的室内毒力测定
药剂名称

药剂浓度(mg/L)
菌落平均直径（cm）
抑菌率(%)
机率值
药剂名称
药剂浓度(mg/L)
菌落平均直径（cm）
抑菌率(%)
机率值
脱氢乙
酸钠
20
6.12
23.0
4.4612
2-萘酚
2
7.93
0.3
2.2522
50
4.15
47.8
4.9448
10
7.05
11.3
3.7893
100
2.88
63.8
5.3531
20
5.55
30.2
4.4813
150
2.54
68.0
5.4677
40
3.38
57.5
5.1891

续表5-1

200
2.08
73.8
5.6372

80
1.68
78.9
5.803
500
1.17
85.3
6.0494
100
0.90
88.7
6.2107
1000
0.58
92.7
6.4538
150
0.63
92.1
6.4118
对羟基苯
甲酸乙酯
2
7.58
4.6
3.3151
聚赖氨酸
2
7.65
3.8
3.2256
20
6.05
23.9
4.2905
20
6.00
24.5
3.8350
50
4.58
42.4
4.8083
50
4.23
46.8
4.9197
100
4.07
48.8
4.9699
100
2.88
63.8
5.3531
200
2.67
66.4
5.4234
200
2.12
73.3
5.6219
500
1.65
79.2
5.8134
500
1.10
86.2
6.0893
1000
0.87
89.1
6.2319
1000
0.76
90.4
6.1264
肉桂醛
50
7.60
4.4
3.294
对羟基
苯甲酸
乙酯钠
50
7.13
10.3
3.8048
100
7.02
11.7
3.8099
100
6.15
22.6
4.316
160
6.44
19.0
3.8877
160
4.78
39.9
4.6971
200
5.97
24.9
4.1619
200
4.12
48.2
4.8718
400
4.19
47.3
4.6308
400
2.62
67.0
5.4399
800
2.15
73.0
5.8239
800
1.52
80.9
5.8742
1600
0.60
92.4
6.4325
1600
0.64
92.0
6.175
空白
-
7.95
-
-

备注：菌落直径均为除去菌块直径后3次重复的平均数，机率值为查生物统计机率值换算表所得。
以各种食品添加剂浓度对数为横坐标，以对应机率值为纵坐标，作出毒力回归方程，分析方程，得出6种食品添加剂的毒力回归方程、相关系数r、EC50和EC90，结果见表6。从表6可得，抑制效果好的3种食品添加剂分别是2-萘酚、脱氢乙酸钠和聚赖氨酸。根据上述三种食品添加剂的EC90值，得出抑制效果最好的是2-萘酚，EC90为122.3162mg/L；其次是脱氢乙酸钠，EC90为732.1524mg/L；最后是聚赖氨酸，EC90为884.0143mg/L。
表6 6种食品添加剂对石榴果褐斑病原菌的室内毒力测定
药剂名称
毒力回归方程
相关系数（r）
EC50 (mg/L)
EC90(mg/L)
2-萘酚
y = 2.2827 x + 1.5165
0.9976
33.5771
122.3162
脱氧乙酸钠
y = 1.1492 x + 2.9896
0.9986
56.1553
732.1524
对羟基苯甲酸乙酯
y = 1.0869 x + 2.9013
0.9973
85.2912
1288.3614
聚赖氨酸
y = 1.2215 x + 2.6825
0.9773
78.9328
884.0143
对羟基苯甲酸乙酯钠
y = 1.6201 x + 1.1111
0.9955
251.4244
1554.0667
肉桂醛
y = 2.1441 x - 0.6034
0.9774
410.5861
1626.0636
2.2.3 3种食品添加剂对石榴贮藏期病害的防治效果
将3种筛选出来的食品添加剂对石榴果实进行浸果试验，贮藏45d后其发病率、发病指数和及防治效果见表7。由表6的结果显示，3种食品添加剂对石榴褐斑病均具有一定的防治效果，其中最好的为2-萘酚，其发病率为22.51%，发病指数是18.08%，防治效果为4853%；对照组发病率为48.16%，发病指数为35.13%。防治效果其次是脱氢乙酸钠；防治效果相对较弱是聚赖氨酸。3种食品添加剂与对照组差异均显著，2-萘酚防治效果最好，与另两种食品添加剂具有显著差异。
表7 食品添加剂对石榴贮藏期病害的防治效果

发病率（%）
发病指数（%）
防治效果（%）
聚赖氨酸
33.55b
26.73b
23.91
脱氢乙酸钠
37.52b
25.68b
26.90
2-萘酚
22.51c
18.08c
48.53
清水
48.16a
35.13a
-
3 结论
通过对石榴果褐斑病症状的观察、病原菌的分离培养、室内毒力测定和浸果试验。结果表明：20种食品添加剂中，3种食品添加剂对石榴贮藏期褐斑病的抑制效果较好，分别是2-萘酚，EC50为33.5771mg/L，EC90为122.3162mg/L，防治效果为48.53%；其次是脱氢乙酸钠，EC50为56.1553mg/L，EC90为732.1524mg/L，防治效果为26.90%；最后是聚赖氨酸，EC50为78.9328mg/L，EC90为884.0143mg/L，防治效果为23.91%。
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致 谢
本论文是在指导老师姚昕的悉心指导下完成的，姚老师对试验方案的设计、技术路线以及论文的撰写都提出了许多宝贵的建议，在试验过程中细心指导，及时地纠正在此过程中出现的错误，使试验及论文能够顺利完成。同时，感谢老师林巧和张忠对论文提出修改的意见，在此谨向姚老师、林老师和张老师致以崇高的敬意和表示衷心的感谢！

独 撰 声 明
我声明，本论文（设计）是由本人在指导教师的指导下独立完成的，在完成论文（设计）时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。

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