基于PCR-HRM的水稻氮高效基因NRT1.1B功能标记开发及应用.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:国家水稻产业技术体系济宁试验站项目()济宁市重点研发计划项目()山东省农业科学院农业科技创新工程项目()山东省重点研发计划(乡村振兴科技创新提振行动计划)项目()山东省农业良种工程项目()作者简介:房文文()女山东肥城人博士助理研究员主要从事水稻抗病育种研究:.通信作者:张士永()男山东寿光人研究员主要从事水稻育种研究:.基于 的水稻氮高效基因.功能标记开发及应用房文文王海凤郭涛薛芳姜艳芳张焕霞张士永(山东省农业科学院湿地农业与生态研究所/山东省水稻工程技术研究中心山东 济南)摘要:水稻对氮肥的高效与合理利用是发展绿色农业的重要保障 培育含有氮高效基因的水稻品种是提高氮肥利用率最经济有效的途径 本研究开发了一个用于(高分辨率熔解曲线)高通量检测硝酸盐转运蛋白基因.的分子功能标记 利用此标记对 份山东地方水稻品种进行.基因分型发现有 个水稻品种为含有.的高效单倍型表明.在山东省水稻品种中分布较少 利用测序分析验证测序结果与本标记分型结果一致 可见本研究开发的功能标记能够快速准确鉴定出.基因型可为筛选和培育氮高效水稻新品种提供有力的技术支撑关键词:水稻高分辨率熔解曲线()氮高效基因.分子功能标记中图分类号:文献标识号:文章编号:().(/).().().水稻作为重要的粮食作物稻谷的稳产与增产对粮食安全至关重要 氮素是水稻需求量最大的营养元素也是制约水稻产量的关键因子 化肥尤其是氮肥的施用对水稻增产和改善稻米品质起了重要作用 但近年来氮肥施用过量已成为水稻生产中普遍存在的问题对生态环境造成了严重破坏 因此培育养分高效型水稻新品种是解决这一问题的关键研究表明籼稻的氮肥利用率显著高于粳稻 培育和选育氮肥利用率高的粳稻品种是困扰育种工作者的难题 等研究揭示了籼、粳稻亚群氮肥利用差异的遗传基础发现硝酸盐转运蛋白基因.单碱基变异是导致籼、粳稻间氮肥利用效率差异的主要原因将籼型.导入粳稻能大幅度提高其氮利用效率即在氮肥减半的条件下产量较对照增加 氮肥利用效率提高 在正常施肥条件下增产 氮肥利用效率提高约 基因序列比对发现籼稻中.基因编码区第 位碱基为 而其在粳稻中等位基因碱基为 从而使编码蛋白的第 位氨基酸分别为蛋氨酸和苏氨酸 根据.基因变异位点方琳等开发了特异性功能标记牛付安等开发了 标记并开展了氮高效粳稻育种 本研究根据.基因的 位点开发了一个用于 检测方法的分子标记并经测序方法验证标记的正确性然后用其对 份山东省地方品种进行.基因分型鉴定为培育氮高效水稻新品种提供技术支持 材料与方法.试验材料水稻材料包括.材料、对照品种日本晴及 份山东省地方品种 由山东省农业科学院湿地农业与生态研究所李平波博士提供其他水稻材料均由山东省种质资源团队收集和保存以常规方法栽培试剂 及 仪 器:十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵()购于生工生物工程(上海)股份有限公司 试剂北京全式金生物技术()有限公司 核酸染料美国 公司 智能型生化培养箱、人工气候培养箱宁波江南仪器厂 型立式冰箱青岛海尔股份有限公司罗氏 实时荧光定量 仪 公司.基因序列分析及标记开发对.基因序列进行分析利用.与其等位基因及对照品种日本晴中的序列差异应用 软件根据差异的 设计引物对 引物均由华大基因公司合成.提取、扩增及 检测采用 法提取水稻样品的基因组 反应体系:母液 模板 正反向引物各.(./).扩增程序:预变性 变性 退火 延伸 共 个循环最后 延伸 后 保存 扩增完成后熔解曲线分析的程序为:变性 退火 以./的速率升温 次/采集荧光信号至 保持 采用 软件进行熔解曲线分析 结果与分析.序列分析及功能标记的设计根据.基因编码区第 位的 变异位点设计分子标记根据位点上下游基因序列设计了 条引物见表 表.基因分子标记引物序列引物引物序列()退火温度/.测序.测序.功能标记的检测及方法分别利用引物组合.、.、.、.对日本晴和 进行扩增分型结果表明利用.引物组合得到的熔解曲线比较平滑能够对两种基 山 东 农 业 科 学 第 卷因型的样品进行多态性区分(图)最终选择.组合作为本研究后续试验采用的引物对 利用日本晴和 对筛选的引物对.的基因分型效果进行验证能够检测出 为含有.基因的高效单倍型而日本晴为不含.基因的野生型红色曲线为含有.基因的高效单倍型蓝色曲线为不含.基因的野生型下同图 水稻.基因熔解曲线结果.功能标记验证进一步利用 等开发的.标记.基于 方法进行验证(图)分型结果与.一致图 利用.标记检测.基因.水稻品种中.的检测利用筛选的引物对检测 份山东省地方水稻品种共检测到 个品种为含有.基因(图 和表)的高效单倍型其他 个品种均不含有.基因 而且 扩增后仅需 即可完成 个样品的.基因分型图 山东地方水稻品种.基因检测结果 第 期 房文文等:基于 的水稻氮高效基因.功能标记开发及应用 表 山东地方水稻品种.基因分型结果编号品种碱基编号品种碱基编号品种碱基小黄稻秋旱稻香稻竹秆青高秸水旱稻水稻大青秸高秸水旱稻郯城野生稻大青秸紫皮水旱稻红皮高丽旱稻大青秸白芒子红皮高丽旱稻竹秆青小白屯水旱稻小红芒香粘稻水旱稻旱稻子香粘稻白米稻紫皮旱稻香粘稻粘稻秋白水稻青旱稻秃头红米稻蒋庄 号蓬莱稻短顶芒白米大长芒旱稻蓬莱稻水斗扬紫颖稻蓬莱稻大红芒塘稻北圆 号大红芒旱糯稻北圆 号佃户屯乡 号汪稻北圆 号石槐水牛皮旱稻清水稻糯米水牛皮旱稻明水香稻糯米木枪秆稻子旱稻小壳旱稻旱稻白芒老旱稻旱粘稻明水米旱稻白砂米旱粘稻明水米旱稻铁耙子白香糯粘旱稻八月芒紫秆旱稻粘旱稻乐陵旱稻紫皮旱稻圆粒水稻葫芦香稻紫皮旱稻半芒水稻小雪稻范李庄 号 注:表中、均为第 位点碱基分别代表不含.基因的野生型、含.基因的高效单倍型.水稻材料.基因型测序验证为了验证.标记检测的准确性对 份水稻材料(紫皮水旱稻、青旱稻、铁耙子、水旱稻、粘稻、旱粘稻、小黄稻、竹秆青、大青秸和大红芒)的.基因进行 扩增然后测序部分测序结果见图 其中 位点碱基是 时基因型为含.基因的高效单倍型 位点碱基是 时基因型为不含.基因的野生型对 份材料的测序结果进行分析发现 份的基因型与 相同分别为紫皮水旱稻、青旱稻、铁耙子、水旱稻、粘稻和旱粘稻 份的基因型与日本晴相同分别为小黄稻、竹秆青、大青秸 和大红芒 测序结果与利用本研究开发标记得到的基因分型结果一致即.标记能够准确鉴定出含有.的材料可为水稻氮高效基因育种提供技术支持 讨论与结论随着水稻功能基因组学的发展已克隆了一个编码()依赖型硝酸还原酶的 克隆了.、.、.、.和 等多个水稻硝酸根吸收和转运基因鉴定了氮高效利用基因.和 兼具早熟、高产、氮高效育种应用价值为氮高效分子育种提供了基因位点随着氮高效基因的挖掘陶亚军等对 份常规籼稻、份常规粳稻和 份太湖资源水稻材料进行氮高效基因鉴定发现 在籼稻中分布较广.、在籼稻中分布较少且在常规粳稻中未被检出常规粳稻中仅含有 方琳等对 份粳稻品种进行.检测发现均无高效基因型 本研究通过开发用于 方法的氮高效基因.的功能标记并对 份山东省地方品种进行.筛选得到 份含有.基因的高效单倍型材料 这为水稻氮高效品种的培育提供了供体材料和技术支撑可加快育种进程 山 东 农 业 科 学 第 卷 分别为紫皮水旱稻、青旱稻、铁耙子、小黄稻、竹秆青和大青秸 的.基因测序结果 位点碱基为 且单峰的与 基因型一致碱基为 且单峰的与日本晴基因型一致图 部分水稻材料.基因 位点的测序分型结果 研究发现聚合籼型 和.位点氮利用效率比单个基因更高 下一步将针对该问题开发可利用的功能标记结合传统育种手段对不同氮高效基因系进行聚合以期将多个基因导入到主推的粳稻品种中以提高氮利用效率参 考 文 献:张福锁王激清张卫峰等.中国主要粮食作物肥料利用率现状与提高途径.土壤学报():.():.:.霍中洋李杰张洪程等.不同种植方式下水稻氮素吸收利用的特性.作物学报():.张璐黄晶高菊生等.长期绿肥与氮肥减量配施对水稻产量和土壤养分含量的影响.农业工程学报():.蒋志敏王威储成才.植物氮高效利用研究进展和展望.生命科学():.():.殷春渊张庆魏海燕等.不同产量类型水稻基因型氮素吸收、利用效率的差异.中国农业科学():.():.方琳陶亚军张灵等.水稻氮高效基因.功能标记开发和资源筛选.分子植物育种():.牛付安周继华程灿等.水稻氮高效基因.的 标记开发与利用/.分子植物育种:.:/./.第 期 房文文等:基于 的水稻氮高效基因.功能标记开发及应用.黄恒王晓丽.采用 与 法提取白术 的研究.安徽农业科学():.(.).:.:.:.:.:./.:.:.陶亚军朱静妍王军等.水稻氮高效基因分子标记开发与基因型筛选.作物学报():.孙平勇张武汉张莉等.水稻氮高效、耐冷基因 功能标记的开发及其利用.作物学报():.山 东 农 业 科 学 第 卷