海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养中甾体类成分研究Ⅱ.pdf

热带海洋学报 JOURNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY 2023 年 第 42 卷 第 5 期:161170 doi:10.11978/2022240 http:/ 海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌 EGF7-0-1 和和 EGF15-0-3共培养中甾体类成分研究 司徒美霞1,雷祖发1,杨倩茹2,邓胜毅1,吴科键2,陈鸿皓2,韦霞1,3,樊浩1,张伟2,张翠仙1 1.广州中医药大学,广东 广州 510006;2.中山大学附属中学,广东 广州 510275;3.广西医科大学,广西 南宁 530021 摘要:文章模拟微生物自然生长环境,对两株海洋本草软珊瑚曲霉属真菌 Aspergillus sp.EGF7-0-1和 Aspergillus sp.EGF15-0-3 进行共培养,以期发现新颖骨架成分。采用硅胶、反相色谱、羟丙基葡聚糖凝胶和高效液相色谱等方法对其次生代谢产物进行分离、纯化;采用高分辨质谱、核磁共振、旋光及物理常数对照等方法对所分离得到的化合物进行结构鉴定;采用全球天然产物分子网络(Global Natural Products Social Molecular Networking,GNPS)方法对次生代谢产物进行分析。从两株软珊瑚来源的曲霉属真菌大米共培养中分离得到 10 个甾体类化合物:Chaxine(1)、Herbarulide(2)、dankasterones A(3)、25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one(4)、Ganodermasides D(5)、Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one(6)、Ergosta-4,7,22-trien-3-one(7)、Isocyathisterol(8)、Stigmasta-4,22-dien-3-one(9)和-sitostenone(10)。化合物 13 均为高度氧化重排的甾体类化合物。化合物 4、5、7 和 9 首次从曲霉属真菌中分离得到。GNPS分析表明与菌株 EGF7-0-1和 EGF15-0-3单培养相比,两株真菌共培养能诱导出更为丰富的甾体类化合物。关键词:海洋本草软珊瑚;共附生曲霉属真菌;共培养;甾体 中图分类号:P745.3 文献标识码:A 文章编号:1009-5470(2023)05-0161-10 Research on the steroids from the coculture of soft coral-associated fungi Aspergillus sp.EGF7-0-1 and EGF15-0-3 SITU Meixia1,LEI Zufa1,YANG Qianru2,DENG Shengyi1,WU Kejian2,CHEN Honghao2,WEI Xia1,3,FAN Hao1,ZHANG Wei2,ZHANG Cuixian1 1.School of Pharmaceutical Sciences,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;2.The Middle School Attached to Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China;3.Pharmaceutical college,Guangxi Medicinal University,Nanning 530021,China Abstract:In order to simulate the growth environment of microorganisms to change or increase the production of secondary metabolites in the presence of other microorganisms and protect the ecological environment of marine herbs,soft coral-associated two fungi Aspergillus sp.EGF7-0-1 and EGF15-0-3 were cocultured on rice medium.Firstly,GNPS(Global Natural Products Social 收稿日期：2022-11-08;修订日期：2022-12-06。殷波编辑 基金项目：广东省自然资源厅省级促进经济高质量发展专项资金(海洋经济发展用途)项目(GDNRC202148、GDNRC2020039);国家自然科学基金项目(82273845、81741160);广州市青少年科技教育项目(KP市 2022027)作者简介：司徒美霞(1997),女,广东省江门市人,硕士研究生,从事天然药效物质基础研究。email: 通信作者：张伟。email:;张翠仙。email: Received date:2022-11-08;Revised date:2022-12-06.Editor:YIN Bo Foundation item:Special fund of Guangdong Provincial Department of Natural Resources for Promoting High-quality Economic Development(Marine Economic Development)(GDNRC202148,GDNRC2020039);National Natural Science Foundation of China(82273845,81741160);Guangzhou Youth Science and Technology Education Project(KP 2022027)Corresponding author:ZHANG Wei.email:;ZHANG Cuixian.email: 162 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.5/Sep.,2023 1 Molecular Networking)method was used to analyze secondary metabolites.Then,the secondary metabolites were separated and purified by silica gel,ODS(Octadecylsilyl),Sephadex LH-20 and HPLC(Preparative High Performance Liquid Chromatography).Their structures were identified by HR-ESI-MS(High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectroscopy),NMR(Nuclear Magnetic Resonance),ORD(Optical Rotatory Dispersion)and the relative physical constants were compared with the literature.Ten steroids were obtained and identified as Chaxine C(1),Herbarulide(2),dankasterones A(3),25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one(4),Ganodermasides D(5),Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one(6),Ergosta-4,7,22-trien-3-one(7),Isocyathisterol(8),Stigmasta-4,22-dien-3-one(9)and-sitostenone(10).Compounds 13 were steroids with oxidative rearrangement and 4,5,7 and 9 were firstly acquired from Aspergillus pared with the single culture of EGF7-0-1 and EGF15-0-3.Based on the coculture strategy,the content types of steroids were more abundant.Key words:soft coral;Aspergillus sp.;coculture;steroid 海洋是新颖甾体的重要来源,这些甾体类化合物往往具有非常规的母核和侧链结构(Darmas et al,2000),表现出强抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、抗衰老和免疫抑制等多种生物活性(Chang et al,2007;Ding et al,2019;肖细姬 等,2019;Liu et al,2021)。文献调研表明甾体骨架上官能团变化可能使其生物活性发生显著变化,高度氧化的甾体多具有抗氧化和抗肿瘤等活性(Sultana,2018)。到目前为止,已有 100 多个甾体类化合物被 FDA 批准应用于临床(Ren et al,2019),同时它们又被发现新的适应症,如最初用于治疗超难治性癫痫状态的 allopregnanolone(Vaitkevicius et al,2017),最近又通过了治疗产后抑郁症的期临床试验(Meltzer et al,2018)。因此,进一步发现骨架新颖、生物活性强的天然甾体化合物具有重要的化学、医药价值。通过模拟目标菌株的自然生长环境进行微生物共培养,既可以通过刺激目标菌株沉默基因的表达影响其次级代谢产物的生成(Okada et al,2017),又因为空间资源有限,通过共培养菌株往往会形成竞争和拮抗关系,而产生单培养中所没有的次生代谢产物,且具良好活性(Oh et al,2005)。课题组前期分别对两株海洋本草软珊瑚共附生真菌 Aspergillus sp.EGF15-0-3 和Aspergillus sp.EGF7-0-1 进行单培养研究(刘炳新 等,2021;黎咏怡 等,2022;Wei et al,2022),研究发现菌株EGF15-0-3 主要产生二酮哌嗪类生物碱、二氢异香豆素、蒽醌、色酮及其杂合二聚体类化合物,菌株EGF7-0-1 主要产生-芳环丁烯内酯类、杂萜类、甾体类、聚酮类(他汀类)化合物;而将两株真菌共培养后发现,不仅代谢出丰富的杂萜类成分(蔡金旋 等,2022),其甾体类成分也比 EGF7-0-1 单培养时丰富。对产生的甾体类成分进行研究,目前共分离鉴定 10个甾体类化合物(图 1)。1 试验部分 1.1 材料与试剂 试验过程中所涉及的仪器与试剂材料见表 1,真菌规模培养所用的大米培养基和 PDB 培养基的配制方法与蔡金旋等(2022)相同。图 1 来源于两株曲霉属真菌 EGF7-0-1和 EGF15-0-3共培养的甾体化合物 110 Fig.1 Steroids 110 司徒美霞等:海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌 EGF7-0-1 和 EGF15-0-3 共培养中甾体类成分研究 163 1 表 1 试验所用仪器与试剂信息表 Tab.1 Instruments and reagents used in the experiment 仪器/试剂 型号/规格 品牌 高分辨液质联用仪 Triple TOFTM 5600+美国 AB SCIEX公司 核磁共振波谱仪 400 MHz AVANCE 型 德国 Bruker公司 高效液相色谱 QuikSep半制备型 北京慧德易科技有限公司 自动旋光仪 MCP 500 安东帕公司 紫外透射反射仪 WFH-201B 上海精科实业有限公司 超净工作台 SW-CJ-1FD 苏州净化设备厂 立式压力蒸汽灭菌器 LS-100H 江阴滨江医疗设备有限公司 电子天平 PWN224ZH 奥豪斯仪器(常州)有限制造公司 旋转蒸发器 XHRE-2000A 上海宵汉实业发展有限公司 低温冷却液循环泵 XHDLSB-5/25 上海宵汉实业发展有限公司 色谱柱 a:Luna 分析柱 4.6mm100mm,5m 美国 Phenomenex公司 色谱柱 b:YMC-Pack ODS-A半制备柱 10mm250mm,5m 日本 YMC Co.,Ltd.公司 色谱柱 c:H&EC18半制备柱 10mm250mm,5m 北京慧德易科技有限公司 常规柱层析硅胶 200300目、300400目 青岛海洋化工厂 Sephadex LH-20 YILIMART 500G 瑞典 cytiva公司 C-18反相色谱填料 YMC*GEL ODS-A-HG 日本 YMC公司 乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷和正丁醇 分析纯 广东光华科技股份有限公司 氘代氯仿 25G 美国剑桥 CIT公司 葡萄糖 分析纯 天津致远化学试剂有限公司 技术琼脂粉 分析纯 广东环凯微生物科技有限公司 土豆、大米、海盐 购于市场 1.2 菌种的活化与规模培养 菌种活化:用无菌接种环分别从 EGF7-0-1 和EGF15-0-3 菌种液体石蜡斜面保存管中蘸取适量菌种,在无菌 PDB 固体培养基中进行活化,待培养基中长出单菌落后,用接种环挑取单菌落于提前准备好的无菌PDB 液体培养基中,28下于恒温摇床(165rmin1)中培养 23d,分别获得两株真菌的种子液。规模发酵:用移液器分别吸取两株真菌的种子液(各 5mL)于无菌大米培养基中对两种真菌进行混合培养,28下静置培养 35d,共培养 400 瓶。1.3 次生代谢产物的提取、分离与纯化 提取:发酵完成后,依次采用乙酸乙酯(EtOAc)和甲醇(MeOH)浸提,EtOAc 提取液减压浓缩得 EtOAc-1浸膏(1250g),MeOH 提取液减压浓缩,用水分散溶解后依次使用乙酸乙酯和正丁醇(n-BuOH)萃取,分别减压浓缩后得 EtOAc-2 浸膏(50g)和 n-BuOH 浸膏(235g),EtOAc-1 和 EtOAc-2 浸 膏 经 薄 层 色 谱(thin-layer chromatograph,TLC)和液相色谱质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析后合并得 EtOAc 浸膏(1300g)。分离与纯化:EtOAc 浸膏(1300g)经硅胶柱层析,以石油醚乙酸乙酯体系梯度洗脱、纯甲醇冲柱,TLC薄层跟踪合并后得 11 个流分:Fr.1 Fr.11,经核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)和 LC-MS 共同分析后,确定甾体目标流分为 Fr.5 和 Fr.6。Fr.5(72g)经硅胶柱层析(EtOAc-PE,体积比 10:9070:30)得到11 个流份 Fr.5-1 Fr.5-11。Fr.5-8(8.5g)经反相色谱(octadecylsilyl,ODS)柱 层 析(H2O-MeOH,体 积 比60:400:100)得到 6 个流份 Fr.5-8-1 Fr.5-8-6。Fr.5-8-3(1.7g)经 半 制 备 高 效 液 相 色 谱(high performance liquid chromatography,HPLC)(H2O-MeOH,体积比 5:95,流速 2mLmin1,为 210nm 和250nm,色谱柱 b)共得到 15个流份 Fr5-8-3-1 Fr5-8-3-15,其 中 得 到 化 合 物 6(R=47min,10mg)、7(R=48min,19mg)、8(R=33min,9.1mg)、9(R=60min,9.2mg)和 10(R=65min,18mg)。Fr.6(34.1g)经硅胶柱层析(EtOAc-PE,体积比 10:9070:30)得到 13 个流份Fr.6-1 Fr.6-13。Fr.6-7(2g)经 Sephadex LH-20(150g)柱层析(CH2Cl2-MeOH,体积比 30:70)得到 12 个流份Fr.6-7-1 Fr.6-7-12,随后 Fr.6-7-3(189mg)经半制备HPLC(H2O-MeOH,体积比 10:90,流速 2mLmin1,为 210nm 和 250nm,色谱柱 b)得到 8 个流份,其中得到化合物 1(R=22min,5.5mg)、2(R=28min,5mg)和 3(R=40min,3.3mg)。Fr.6-9(2.5g)经 Sephadex LH-20(150g)柱层析(CH2Cl2-MeOH,体积比 30:70)得到 12 个流份 Fr.6-9-1 Fr.6-9-12,Fr.6-9-3(300mg)经半制备HPLC(H2O-MeOH,体积比 15:85,流速 2mLmin1,为 210nm 和 250nm,色谱柱 c)得到 10 个流份 Fr.6-9-3-1 Fr.6-9-3-10,其中得到化合物 4(R=23min,24mg)和 5(R=58min,14mg)。1.4 物理常数与波谱数据 化合物 1:白色无定型粉末(MeOH),25 D+50.1 164 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.5/Sep.,2023 1(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 441.2980 M+H+(计算值:C28H41O4+441.2960),分子式 C28H40O4。1H 和13C NMR 数据见表 2和表 3。化 合 物2:无 色 片 状 结 晶(MeOH),熔 点:139141(MeOH),25 D+169.2(c 0.1,CH2Cl2),HR-ESI-MS:m/z 425.3039 M+H+(计算值:C28H41O3+425.3011),分子式 C28H40O3。1H 和13C NMR 数据见表 2和表 3。化 合物 3:黄色油 状物,25 D+60.2(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 425.3030 M+H+(计算值:C28H41O3+425.3011),分子式 C28H40O3。1H 和13C NMR 数据见表 2和表 3。化合物 4:黄色无定型粉末(MeOH),25 D+560.1(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 409.3076 M+H+(计算值:C28H41O2+409.3062),分子式 C28H40O2。1H 和13C NMR 数据见表 2和表 3。化合物 5:黄色油状物,25 D+287.3(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 409.3089 M+H+(计算值:C28H41O2+409.3062),分子式 C28H40O2。1H 和13C NMR 数据见表 2和表 3。化合物 6:黄色固体(MeOH),25 D+582.6(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 393.3127 M+H+(计算值:C28H41O+393.3113),分子式 C28H40O。1H 和13C NMR数据见表 2和表 3。化合物 7:无色针状结晶(MeOH),熔点:112114(MeOH),25 D+9.1(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 395.3295 M+H+(计算值:C28H43O+395.3269),分子式C28H42O。1H和13C NMR数据见表 2和表 3。化合物 8:白色固体(MeOH),25 D+64.2(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 411.3237 M+H+(计算值:C28H43O2+411.3218),分子式 C28H42O2。1H 和13C NMR 数据见表 2和表 3。化合物 9:白色固体(MeOH),25 D+39.6(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 411.3606 M+H+(计算值:C29H47O+411.3582),分子式 C29H46O。1H 和13C NMR数据见表 2和表 3。化合物 10:无色针状结晶(MeOH),熔点:6769(MeOH),25 D+62.2(c 0.1,CHCl3),HR-ESI-MS:m/z 413.3747 M+H+(计算值:C29H49O+413.3739),分子式C29H48O。1H和13C NMR数据见表 2和表 3。表 2 化合物 110 的 1H NMR数据(400MHz,CDCl3,H,多重峰 mult,偶合常数 J in Hz)Tab.2 1H NMR Data of 110 in CDCl3 No.1 2 3 4 5 4 6.03,d,10.1 5.74,s 6.36,s 5.74,s 5.88,s 6 6.04,d,9.5 6.12,d,9.6 7 5.64,d,2.4 5.72,s 2.65,dd,16.9,1.5 6.60,d,9.5 6.49,d,9.6 9 2.81,t,9.1 18 0.87,s 0.63,s 0.98,s 0.96,s 0.96,s 19 1.47,s 1.23,s 1.26,s 0.99,s 1.11,s 21 1.02,d,6.6 1.02,d,6.6 1.09,d,7.1 1.08,d,6.7 1.08,d,6.7 22 5.14,dd,15.3,8.4 5.14,dd,15.3,8.4 5.24,dd,15.2,6.0 5.34,dd,15.2,7.6 5.20,dd,15.3,7.9 23 5.26,dd,15.3,7.7 5.25,dd,15.2,7.6 5.28,d,15.2,6.1 5.39,dd,15.2,7.8 5.27,dd,15.3,7.2 26 0.84,d,6.8 0.82,d,6.8 0.81,d,6.8 1.14,s 0.83,d,6.8 27 0.82,d,6.8 0.82,d,6.8 0.83,d,6.8 1.17,s 0.85,d,6.8 28 0.91,d,6.8 0.91,d,6.8 0.91,d,6.8 1.01,d,6.7 0.93,d,6.9 No.6 7 8 9 10 4 5.73,s 5.79,d,2.0 5.72,s 5.72,s 5.71,s 6 6.03,d,9.5 6.09,d,9.6 7 6.61,d,9.5 6.16,d,9.6 18 0.96,s 0.60,s 1.02,s 0.73,s 0.70,s 19 0.99,s 1.17,s 1.32,s 1.18,s 1.17,s 21 1.06,d,6.7 1.03,d,6.6 0.99,d,6.6 1.02,d,6.6.91,d,6.5 22 5.26,dd,15.2,7.1 5.16,dd,15.2,7.7 5.12,dd,15.3,8.2 5.15,dd,15.2,8.5 23 5.20,dd,15.2,7.8 5.23,dd,15.2,6.9 5.22,dd,15.3,7.6 5.02,dd,15.2,8.5 26 0.83,d,6.8 0.82,d,6.5 0.82,d,6.8 0.84,d,6.3 0.83,d,6.8 27 0.85,d,6.8 0.84,d,6.5 0.83,d,6.8 0.79,d,6.3 0.82,d,6.8 28 0.93,d,6.9 0.91,d,6.5 0.91,d,6.8 29 0.80,t,7.3 0.84,t,7.3 司徒美霞等:海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌 EGF7-0-1 和 EGF15-0-3 共培养中甾体类成分研究 165 1 表 3 化合物 110 的 13C NMR 数据(100MHz,CDCl3,C,type)Tab.3 13C NMR Data of 110 in CDCl3 No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 32.1,t 33.9,t 39.0,t 34.1,t 27.6,t 34.3,t 33.2,t 35.2,t 35.7,t 35.7,t 2 24.8,t 33.2,t 34.5,t 34.1,t 34.0,t 34.3,t 34.3,t 33.8,t 34.0,t 32.1,t 3 148.8,d 198.4,s 199.3,s 199.7,s 199.5,s 199.7,t 199.6,s 199.9,s 199.7,s 199.8,s 4 128.1,d 114.7,d 126.7,d 123.2,d 126.4,d 123.1,d 122.8,d 125.3,d 123.8,d 123.7,d 5 195.8,s 173.9,s 156.2,s 124.7,s 161.4,s 124.6,s 169.2,s 163.5,s 171.7,s 171.9,s 6 164.3,d 162.4,s 200.2,s 124.7,d 124.8,d 124.6,d 33.2,t 128.2,d 33.0,t 33.0,t 7 117.5,d 113.3,d 41.0,t 134.1,d 130.9,d 134.2,d 115.7,d 139.4,d 32.0,t 33.9,t 8 156.2,s 159.5,s 62.3,s 164.5,s 126.7,s 164.5,s 139.7,s 71.9,s 35.6,d 35.6,d 9 204.6,s 47.2,d 49.5,d 44.5,d 72.6,s 44.5,d 45.9,d 53.3,d 53.8,d 53.8,d 10 81.2,s 40.4,s 36.1,s 36.9,s 42.4,s 36.9,s 38.2,s 36.3,s 38.6,s 38.7,s 11 39.0,t 25.4,t 25.3,t 19.0,t 25.5,t 19.1,t 22.1,t 18.0,t 21.0,t 21.0,t 12 38.0,t 39.1,t 38.5,t 35.6,t 32.1,t 35.7,t 39.1,t 40.9,t 39.5,t 39.4,t 13 46.5,s 47.0,s 54.1,s 44.2,s 44.6,s 44.1,s 43.5,s 44.2,s 42.3,s 42.5,s 14 57.9,d 58.1,d 215.0,s 155.7,s 158.3,s 156.3,s 55.1,d 57.2,d 56.0,d 56.0,d 15 21.9,t 22.6,t 38.1,t 25.3,t 25.7,t 25.5,t 23.0,t 19.1,t 24.3,t 24.2,t 16 29.1,t 27.7,t 23.3,t 27.7,t 27.8,t 27.9,t 28.2,t 28.2,t 28.9,t 28.2,t 17 55.3,d 56.3,d 49.5,d 55.6,d 55.7,d 55.8,d 55.9,d 56.6,d 55.9,d 55.9,d 18 12.1,q 12.5,q 17.2,q 19.1,q 17.9,q 19.1,q 12.3,s 14.6,q 12.2,q 12.0,s 19 21.9,q 20.0,q 24.2,q 16.8,q 20.9,q 16.8,q 21.4,q 19.0,q 17.4,q 19.0,s 20 40.1,d 40.2,d 37.4,d 39.5,d 39.3,d 39.4,d 40.6,d 39.9,d 40.5,d 36.1,d 21 21.0,q 21.0,q 23.8,q 21.2,q 21.3,q 21.4,q 21.2,q 20.7,q 19.0,q 18.7,q 22 134.6,d 134.7,d 132.5,d 138.4,d 134.9,d 135.2,d 135.6,d 135.4,d 138.1,d 34.0,t 23 132.9,d 132.8,d 135.3,d 129.9,d 132.9,d 132.7,d 132.4,d 132.3,d 129.5,d 29.1,t 24 42.8,d 42.8,d 43.4,d 48.3,d 43.0,d 43.0,d 42.9,d 43.0,d 51.2,d 45.8,d 25 33.0,d 33.1,d 33.2,d 72.5,s 33.2,d 33.2,d 33.0,d 33.2,d 31.9,d 26.1,d 26 19.7,q 20.0,q 19.8,q 27.1,q 19.8,q 20.1,q 20.1,q 19.8,q 21.2,q 17.4,q 27 20.0,q 19.6,q 20.2,q 26.6,q 20.1,q 19.8,q 19.8,q 20.1,q 21.1,q 19.8,q 28 17.6,q 17.6,q 17.1,q 15.8,q 17.8,q 17.8,q 17.7,q 17.8,q 25.4,t 23.1,t 29 12.3,q 12.0,q 1.5 LC-MS 分析及 GNPS 建立 样品配制:取两株真菌共培养、EGF7-0-1 单培养、EGF15-0-3 单培养浸膏配制成 1.0mgmL1甲醇溶液,备用。超 高 效 液 相 色 谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)条件:流动相、流速和柱温等与文献(蔡金旋 等,2022)相同,进样量为 5L,色谱柱a,将样品于 Triple TOFTM5600+质谱中测试。质谱(mass spectrometry,MS)条件:离子喷雾电压、雾化器压力、辅助气压力、气帘气压力、离子源温度、碰撞能量、扩散碰撞能量、去簇电压、飞行时间质谱(TOF-MS)分子量扫描范围等条件与文献(蔡金旋 等,2022)相同。全球天然产物分子网络(global natural products social molecular networking,GNPS)构建方法:二级质谱原始数据文件(.wiff 格式)通过 MSConver 软件转换成网络可识别的格式(.mzXML 格式),将转换后的数据通过 FileZilla 软件提交至 GNPS 数据中转站,登录GNPS 网站服务器(https:/gnps.ucsd.edu),按要求设置参数(cosine 值为 0.8,最低匹配峰值为 6,母体离子质量差为0.02Da,碎片离子质量差为0.02Da)建立GNPS 分子网络图,生成数据后导出采用 Cytoscape软件进行分析。LC-MS 分析方法:使用 peakview 软件进行目标性筛查,通过 peakview 软件打开质谱原始数据文件,显示总离子流图(total ion chromatography,TIC)图,根据目标化合物的分子式和离子化形式提取粗流份中的目标峰(显示相应的 RT 值、Error Da 和 Formula 等信息)。以此方法确定甾体化合物在 3 种培养基中的存在情况。数 据 分 析 处 理 软 件:GNPS分 析 采 用ProteoWizard(MS Conver)、FileZilla 和 Cytoscape。LC-MS 分析采用 Triple TOFTM5600+质谱系统自配的peakview和 analysis 数据处理软件。166 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.5/Sep.,2023 1 2 结果及分析 2.1 结构解析 化合物 1:HR-ESI-MS m/z 441.2980 M+H+(计算值:C28H41O4+441.2960),13C NMR和无畸变极化转移增强谱图(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer,DEPT)信息显示 28个碳(7个 C、9个 CH、6个 CH2和 6个 CH3),确定 1 的分子式为 C28H40O2,不饱和度为 9。NMR 信息提示 1 含有 1 个长程共轭酮酯羰基(C 164.3,s,C-6、117.5,d,C-7、156.2,s,C-8、204.6,s,C-9;H 5.64,d,2.4,1H,H-7)、1个,-共轭酮羰基(C 148.8,d,C-3、128.1,d,C-4、195.8,s,C-5;H 6.866.91,m,1H,H-3、6.03,d,10.1Hz,1H,H-4)、1个三取代双键(C 134.6,d,C-22、132.9,d,C-23;H 5.14,dd,15.3,8.4Hz,1H,H-22、5.26,dd,15.3,7.7Hz,1H,H-23)、1 个连氧且不含氢原子的碳(C 81.2,s,C-10)、6个麦角甾体特征甲基(C 12.1,q,C-18、21.9,q,C-19、21.0,q,C-21、19.7,q,C-26、20.0,q,C-27、17.6,q,C-28;H 0.87,s,3H,H3-18、1.47,s,3H,H3-19、1.02,d,6.6Hz,3H,H3-21、0.84,d,6.8Hz,3H,H3-26、0.82,d,6.8Hz,3H,H3-27、0.91,d,6.8Hz,3H,H3-28),除此外无任何不饱和度信息,说明该化合物含有3 个环,推测其为发生了氧化重排的麦角甾类化合物(Mccloskey et al,2017)。将 1 的 NMR 信息与 Chaxine C 对照(Choi et al,2009;Hirata et al,2017),二者基本一致,确定 1 为 Chaxine C。化合物 2:HR-ESI-MS m/z 425.3039 M+H+(计算值:C28H41O3+425.3011),13C NMR 和 DEPT 信息显示 28 个碳(6 个 C、10 个 CH、6 个 CH2和 6 个 CH3),确定其分子式为 C28H40O3,不饱和度为 9。根据NMR 信息提示结构中含有 1 个氧取代,-共轭酮羰基(C 198.4,s,C-3、114.7,d,C-4 和 C 173.9,s,C-5;H 5.74,s,1H,H-4)和 1 个,-共轭内酯基(C 162.4,s,C-6、113.3,d,C-7 和 C 159.5,s,C-8;H 5.72,s,H-7),推测其亦为高度氧化重排的麦角甾类化合物(Krohn et al,1999)。将 2 的 NMR 信息与 herbarulide对照(Duecker et al,2020),二者基本一致,确定 2 为herbarulide。化合物 3:HR-ESI-MS m/z 425.3030 M+H+(计算值:C28H41O3+425.3011),13C NMR和 DEPT 信息提示28个碳(7个 C、8个 CH、7个 CH2和 6个 CH3),确定其分子式为 C28H40O3,不饱和度为 9。NMR 信息提示结构中有 1 个长程,-共轭双酮羰基(C 199.3,s,C-3、26.7,d,C-4、156.2,s,C-5、200.2,s,C-6;H 6.36,s,1H,H-4)、1个孤立酮羰基(C 215.0,s,C-14)、1 个三取代双键(C 1132.5,d,C-22、135.3,d,C-23;H 5.24,dd 15.2,6.1Hz,1H,H-22、5.28,d,15.2,6.0Hz,1H,H-23),提示该化合物含有 4 个环。严格分析 3 的NMR 数据发现增加了 1 个明显向低场移动的饱和季碳信息(C 62.3,s,C-8),提示其可能环结构发生改变且高度氧化重排的麦角甾类化合物(Hu et al,2017)。将3 的 NMR信息与 Dankasterone A对照(Amagata et al,2007),二者基本一致。故确定 3 为 Dankasterone A。化合物 4:HR-ESI-MS:m/z 409.3076 M+H+(计算值:C28H41O2+409.3062),13C NM