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离子交换色谱Ion exchange chromatography,IEC2024/5/12 周日.内 容一、离子交换色谱的基本原理一、离子交换色谱的基本原理二、离子交换剂的基本性质二、离子交换剂的基本性质三、离子交换介质的选择原则三、离子交换介质的选择原则四、离子交换色谱的基本操作四、离子交换色谱的基本操作.一、基本原理1 1、基本原理、基本原理以离子交换树脂等作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。.2、平衡常数、平衡常数离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+发生可逆交换反应：RA+B+RB+A+离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的选择性可用平衡常数K表示：.1 2 3 4 5反离子反离子样品溶液样品溶液梯度溶液1-平衡阶段：离子交换剂与反离子结合平衡阶段：离子交换剂与反离子结合 2-吸附阶段：样品与反离子进行交换吸附阶段：样品与反离子进行交换3,4-梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，再洗下强吸附物质梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，再洗下强吸附物质5-再生阶段：原始平衡缓冲液进行充分洗脱，即可重复使用再生阶段：原始平衡缓冲液进行充分洗脱，即可重复使用 图1 IEC原理示意图.二、离子交换剂的基本性质1、离子交换剂应具备高度的不溶性，保证在各种溶剂中不会发生溶解；2、具备稳定的理化性质，不能因物理化学变化而发生分解；3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构，确保交换离子自由地发生扩散和交换。.离子交换剂1、疏水性离子交换剂、疏水性离子交换剂与水亲和力较小的人工合成树脂（1）阳离子交换剂阳离子交换树脂具有酸性基团，电荷基团带负电，反离子带正电，可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。（2）阴离子交换剂阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺-NH2、仲胺-NHCH3、叔胺-N(CH3)2和季胺-N+(CH3)3基团后构成的。.2、亲水性离子交换剂、亲水性离子交换剂基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物（1）纤维素离子交换剂以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成，最为广泛使用的是二乙氨基乙基（DEAE-）纤维素和羧甲基（CM-）纤维素。（2）交联葡聚糖离子交换剂以交联葡聚糖G-25和G-50为基质，通过化学方法引入电荷而制成的。（3）琼脂糖离子交换剂 以交联琼脂糖CL-6B为基质，引入电荷基团而构成。.三、离子交换剂的选择原则1、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负电荷，应选用阴离子交换剂。（2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH中解离且较稳定的物质；弱型则适宜用来分离生物大分子，活性不易丧失。（3）在分离生物大分子物质时，由于亲水性基质对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，生物活性不易破坏而常被选用。（4）交换容量：通常选用离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换能力较大的介质。（5）交换速度：一般选用交换速度快的介质。.2、缓冲液的选择、缓冲液的选择（1）对于两性蛋白质来说，缓冲液的pH决定蛋白质在该缓冲体系下所带的电荷，以一个pI为5的蛋白为例：蛋蛋白白质质净净电电荷荷pH pIpH pIpH pI（-）11吸附阳离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附阴离子交换剂等电点等电点22334455667788991010pHpH+-图2 蛋白质静电荷与pH的关系.（2）在离子交换剂的交换容量固定的情况下，起始缓冲液的浓度应尽可能的低（3）缓冲液离子不影响被分离蛋白或干扰其活性，同时不应影响目标蛋白的溶解度。.四、离子交换色谱的基本操作图3 IEC装置示意图.（一）（一）交换剂的预处理、再生交换剂的预处理、再生（1）用水浸透使干树脂吸水溶胀，再用酸、碱处理除去水中的不溶性杂质。（2）再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的处理过程。（二）（二）交换剂装柱交换剂装柱（1）离子交换色谱柱的选用（2）装柱 垂直装柱，严防气泡和断层。.当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长增加柱长为宜，使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用粗而短的柱子粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就增加了脱附离子扩散的机会。.（三）（三）样品上柱、洗脱和收集样品上柱、洗脱和收集（1）上柱（2）洗脱IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度增加离子强度，置换出被吸附的离子；另一种是改变改变pH，使被吸附的离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。（3）收集用部分收集器分部收集，收集体积一般为柱体积的1%2%。.Thank you！.