现代分子诊断技术.ppt

利用核酸双链的利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性和复性的原理，原理，可以可以用已知碱基序列的单链核酸片段用已知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针，与待，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在源核酸序列的存在 核酸探针核酸探针 是指带有标记的某一特定是指带有标记的某一特定DNA或或RNA片断，能与片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列源序列 探针标记物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素（生物素、地高辛、（生物素、地高辛、荧光素等）两大类荧光素等）两大类.分离杂交探针的方法：分离杂交探针的方法：1.1.提取某一病原微生物株系的染色体提取某一病原微生物株系的染色体DNADNA2.2.限制性内切酶进行酶解限制性内切酶进行酶解 3.3.得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 4.4.文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核微生物和非病原性微生物的核DNADNA进行杂交、筛选进行杂交、筛选.核酸杂交的灵敏度和可靠性极高核酸杂交的灵敏度和可靠性极高用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化进行杂交，且无需预先纯化DNA若样品中的目标分子非常少，则需通过若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的将目的序列扩增，再进行杂交检测序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用从理论上讲，用DNADNA杂交来诊断疾病可用杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测于对所有的致病微生物的检测.4、非同位素标记探针、非同位素标记探针3232P P的缺点：的缺点：半衰期短，仅半衰期短，仅1313天天操作起来比较危险操作起来比较危险必须要有特殊的实验室设备进行操作必须要有特殊的实验室设备进行操作放射性垃圾的处理繁琐放射性垃圾的处理繁琐.非放射性杂交检测系统：非放射性杂交检测系统：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的发光物质而达到放大信号的目的采用将生物素（采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入）标记的核苷酸掺入DNA的方的方法制备探针法制备探针生物素标记的生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年在室温下至少可保存一年检测发光和颜色变化可在几小时内完成检测发光和颜色变化可在几小时内完成.BBBBAPBBAP生物素生物素加入链霉素抗生物蛋白加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记的碱性磷酸酶加入生物素标记的碱性磷酸酶探针探针目的目的DNA加入不同的生色或化学发光底物加入不同的生色或化学发光底物.荧光标记的引物直接进行荧光标记的引物直接进行PCR检测检测DNA引物引物1引物引物2荧光染料荧光染料PCR层析层析荧光检测荧光检测游离引物游离引物.分子夹心探针检测分子夹心探针检测发出荧光发出荧光分子夹心探针分子夹心探针(没有荧光没有荧光)荧光团荧光团猝灭剂猝灭剂目的目的DNA与目的与目的DNA杂交杂交.TaqMan探针技术探针技术原理：原理：利用利用Taq酶的酶的3 5外切核酸酶活性，切断探针，外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量光的强弱就代表了模板的数量.3553QR上游上游引物引物下游下游引物引物5 335 QRTaqMan探针的荧光信号产生机制探针的荧光信号产生机制.疟疾的分子诊断：疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫检测是否存在疟原虫1.抽取血样进行镜检抽取血样进行镜检 2.免疫诊断免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染无法区分是以前感染还是现在感染3.DNA杂交诊断杂交诊断例一：例一：.DNADNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNADNA序列序列具体的分离过程：具体的分离过程：1.1.构建一个疟原虫的核基因文库构建一个疟原虫的核基因文库2.2.用标记的疟原虫核用标记的疟原虫核DNADNA作探针去筛选核基因文库作探针去筛选核基因文库3.3.选出那些杂交信号最强的克隆选出那些杂交信号最强的克隆4.4.用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为为DNADNA探针的可靠性探针的可靠性.锥虫的检测锥虫的检测锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞显微镜检新鲜血液显微镜检新鲜血液取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40,30-40天后天后杀死昆虫杀死昆虫,镜检昆虫的肠道镜检昆虫的肠道免疫检测免疫检测:假阳性高假阳性高例二：例二：.PCR检测检测针对针对锥虫特有的一段锥虫特有的一段188bp的的DNA序列设计引序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的的条带条带.二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术抗生素的不合理使用抗生素的不合理使用DNA杂交杂交PCR检测检测噬菌体介导噬菌体介导.DNA杂交杂交设计设计16SrRNA16SrRNA为探针为探针16SrRNA16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性在细菌中拷贝数极高，高度的保守性特异性不是很好特异性不是很好必须结合必须结合PCRPCR技术技术.PCR检测检测nested PCRnested PCR针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物物 每对引物都能特异的扩增出一段目每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加的片段，病原菌存在的可能性大大增加.模板模板使用外引物，进行第一使用外引物，进行第一次次PCR扩增扩增使用内引物，进行第二使用内引物，进行第二次次PCR扩增扩增第一次第一次PCRPCR扩扩增产物增产物第二次第二次PCRPCR扩扩增产物增产物巢式巢式PCRPCR原理示意图原理示意图.PCR技术也会产生假阳性技术也会产生假阳性1.1.新扩增的目的新扩增的目的DNADNA特异性不强特异性不强2.2.退火温度过低退火温度过低3.3.模板中杂质的污染模板中杂质的污染假阴性假阴性1.1.存在存在TaqTaq酶的抑制剂酶的抑制剂2.2.模板量过少模板量过少3.3.模板模板DNADNA纯度不够纯度不够.原位原位PCR(in situ PCR,ISPCR)在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测增，并通过原位杂交进行检测不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位胞中定位.原位杂交原位杂交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的进而检测特异的DNADNA或或RNARNA序列序列 细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交 DNA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点：不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态有有.噬菌体介导细菌检测噬菌体介导细菌检测将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品转基因噬菌体去侵染待测样品噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和光素和ATPATP，就会有荧光产生，就会有荧光产生结核菌的检测结核菌的检测抗药性菌株的检测抗药性菌株的检测.荧光素酶荧光素酶荧光素荧光素ATP荧光荧光利用宿主细胞利用宿主细胞转录、翻译转录、翻译噬菌体基因噬菌体基因荧光素酶荧光素酶基因基因宿主细菌宿主细菌噬菌体介导的细菌检测噬菌体介导的细菌检测.第三节第三节 DNA指纹指纹v每个人体细胞内都每个人体细胞内都含有含有23对染色体，每对染色体，每条染色体中部含有一条染色体中部含有一个个DNA分子，分子，DNA分子分子中的核苷酸序列包含中的核苷酸序列包含着遗传信息，在着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重度重复序列、高度重复序复序.每个重复序列在每个重复序列在300300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要列经过超离心后以卫星带出现在主要DNADNA带的附近，所以也带的附近，所以也称卫星称卫星DNADNA，其中的重复序列单元则称为，其中的重复序列单元则称为“小卫星小卫星DNA”DNA”“小卫星小卫星”具有高度的可变性，但在具有高度的可变性，但在“小卫星小卫星DNA“DNA“中有中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列核心序列”。如。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNADNA进行进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作一样具有专一性和特异性，因此称作“DNADNA指纹指纹”通过对人类基因组的解析，发现人与人之间通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99999999的碱的碱基序列都相同，而剩下的基序列都相同，而剩下的0.01%0.01%的碱基特征序列则来自于双的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于亲，据此可用于“亲子鉴定亲子鉴定”.所罗门的审判：所罗门的审判：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是 所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其 辟成两半分给他们两，辟成两半分给他们两，结果假母亲同意所罗结果假母亲同意所罗 门的判决，而孩子真门的判决，而孩子真 正的母亲却恳求侍卫正的母亲却恳求侍卫 饶了孩子的性命，她饶了孩子的性命，她 解释说：解释说：“把孩子给了把孩子给了 假母亲，总比让孩子假母亲，总比让孩子 惨死好。惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了当然，真假母亲也就水落石出了。.滴骨验亲法：滴骨验亲法：以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。多种记录。三国时代（公园三国时代（公园220220280280年）谢承著年）谢承著会稽先会稽先贤传贤传中的中的以弟血滴兄骨以弟血滴兄骨可能是记录此法的最可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。.合血法：合血法：等到了明代，更是采用了等到了明代，更是采用了“合血法合血法”来识别亲来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。也。”.方法：方法：DNADNA指纹是指对待测样品中的指纹是指对待测样品中的DNADNA进行分析进行分析所得到的具有特征性的所得到的具有特征性的DNADNA分子杂交图谱分子杂交图谱DNA DNA 酶解酶解 电泳电泳 转膜转膜 杂交杂交最常用的最常用的DNADNA探针是微卫星序列探针是微卫星序列受害者血样受害者血样犯罪嫌疑人犯罪嫌疑人衣物上血样衣物上血样犯罪嫌疑犯罪嫌疑人血样人血样.