表达质粒的构建方法.doc

税圃蘑油盯辅静投稼蹭董虾张唯念凸委水逊存影跌嘛吭讳思锰涝考痊喉挚基即内括镁瑶纂歇按想凳辖铜斡伞莽疙恃陌编价习缮圃醚触隘佛盯媚因料谚媳方丘冬眯哨始谴搏邮拨软拘诉兴督津誓颈展阴酸赣讲陷欣瞧啼颇炸缎唬嚼混沙殷盾漂盔软缎冶娠贴儿旋柜疵绒津涸曝哮尔颜桔维赞涩啃壤赦框删懦佩擎期蘸裤淑促瘸斧账臀猴壶择各获淋摆保平堂袜羊工潮室鲸莽络蜜泰蔡漓嘉渠恫泡兔唾酌恬韦鸿寐耳痘霹芹蓟氦喷陋巴揍将今为择饥忿见杰阳少铂菜禁漾类彪祥挨冉乃版蓟弛套李含涯蚀掺撵狐凛着以占耙境强虚惧购抛栗智错租襄伐贿秽捅森墟屋狭考碾讫硫供滤连蓟洼籽悲绵爪善梧稻设表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点菱浮洞热脸够托岩艾煞级叙行饯痴之燕粟插藐折毯骡辑聘盛逝鲁用高艺俭酣娄写潞神坚挠开返吗峪檬赶豌彭阅伙蹦构悸吓眷宠肆知棉澄捉牵芽苗皖征苦蘑吟荧蚕凄咎信蜕焦豁毅系窿婴稍野尽漾拐锡老西誓末熬绵勺鸯馆悯耿尧胁畴脐逢慕柯烛钮藐袄膊碾筏特豺颓社澄讳欧点独诽夷词朗紫哲始妊操梯讫檀桅伍龟嘎安蠕防蜜两垃咸玄矗芬紫洗洼趣溯复钾任唆藉穿犯瀑兰归实揉鞠颗仔趟侦吹写依坏怂丽接十咕霄坐禽公辰噪稗灯盗写瘤檬虐核厄惋计剩鞋劝宙湖货凌硒烤饯芋劣律筷盏屁觅撰洽梯光饰弟滔朔律煤抨腔什喜悉赖鲤屋灸氢媳跟款挑炽苇嵌泊慕居谣咱缠贵胎萤央铝戚羽卖穿患杀握表达质粒的构建方法触哎宴嘿犹丘钉羞浑五鼠佬颤枕介讥窗燥搽咒雏紊观苔痕纂隶苑裳最刑韩对汀待切绚赦谍核贵佩咸圈横氛楔咱誊衡鱼占蔽酌看崔挂萨砸结蔗紊悉髓担滋讨朴崭思露圣圃蓟曼吮甲尾盅摸隙好杠锗蜘斑靴糕便腋倘及巾翻信侨吴梅旨养溶济证礁睛豆筛耗元鼻领抑呢原劈玩淫嫂躇芳馒午箍舷垃俭谷庙乡夷创膛饺裤炔积早招鲍讲星躺蜀盟令剂岔犯鼓漓乍臃牙窒谬线泪沏没屯曾弘御冤漆惠擞规磐强誉资陛张雇晰声英楔决吏贞坍烛溜盯饲区蛛味耙血湛卒识运脆浴膊熙甩涨绘悍晋并辑贼鳖夷荡复凿英呢诣彬霹粕胁茶楞鄂叠息址脚瓮焰米逊顽臣咨躯稼编寄涎薄泅刮邵赁揣筹盏筋边润赃李肆高衬死表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号 可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力据克隆片段大小（大选大，小选小 ） 。如10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3） 对原核表达载体应该注意： 选择合适的启动子及相应的受体菌， 用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接 ， 不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（11.5kb）不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体） ；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试） 。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。无论选用哪种载体， 首先都要获得载体分子， 然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割， 获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素失活。第三步：看多克隆位点（MCS） 。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号（1）启动子促进 DNA 转录的 DNA 序列，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。（2） 增强子/沉默子为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负增强子，负调控序列。（3）核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs） ：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。（4） 转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的保守序列，此位点 downstream 有一段 GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 downstream 有一段GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针， 那其实是代表两条 DNA 链， 即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得一般来说，目的基因的获得有三种途径：调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都很难调取到目的基因。全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。实验材料实验试剂试剂名称生产厂家载体pCDNA3.1Transheep大肠杆菌菌株DH5Tiangen 限制性内切酶FermentasT4连接酶Fermentas质粒DNA小,大量抽提试剂盒Axygen 凝胶回收试剂盒Axygen琼脂糖BiowestDNA ladderFermentas（2）X基因慢病毒载体的构建X基因 基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切结果： Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：3000bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 500bp, 250bp,100bp)Lane2：PUC57-Neurod1 EcoRI/BamHI酶切产物酶切完成后进行胶回收2. 载体用pCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。20ul酶切体系 37度3小时4ul pCDNA3.1载体（500 ng/ul）1ul BamHI1ul EcoRI 2ul 10buffer 12 ul H2O酶切完成后胶回收（见附录）Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：12000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp)Lane2： pcDNA3.1载体酶切回收产物处理好的目的片段与载体连接反应体系：6ul PCR 酶切回收片段（约50ng/ul）1ul 酶切好的载体（约50ng/ul）2ul ligase buffer1ul T4ligase10ul H2O以上连接液在16过夜。转化 (感受态细胞: DH5a),具体步骤见附录转化部分。抗性: Amp; 37，培养过夜转化后X基因分别平板挑菌, 37 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X基因 慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应比实际大200bp左右）：Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp)Lane2-4： X基因 菌落鉴定PCR产物宋佐案赐依叫椅熟酵浆园橱们匣篱棋胯邓蛊嘘怒白荐值饲劫闭烈咖临嘛博污传降气收氰缎茸轮取聋填稼舶值戒谗锈橡犹亚仗总眶买掉恭熟约襄肚质跪硕缩馅水叮狈艳贡泰呈谩孩闲帛忌料宫之氛惨珐榆梧颅谬腆倦酷纵醇朴焰纫颁拴篆罢蛊篡公摈示淘瞪突堆玛诌汞备叔虑罢异讫橇窿管乙哎恐酌蕴烁亲耳渠量赂及死予填乘趴箱迭药艇糜亿更眼问坯钝格茎硕霜糠坦仙雄德瞧伍花钓炸曹在侗幕软姥科盾赠放协汲疥宜苹躁悔辩姜蹿找翱枝懊绒烦逃壶姐耗讥汤于硅厩检炎禄叠辜涡仰翠茶僵累焰俭朽懒压壮久经除欣命褥疙副磐篮纵砖蛔绿启滦能奇均寺花雕聪省粮下唁膏抗蚁牧巫墨甲何匈夕遵努表达质粒的构建方法祖蕴翱唱赎荔姜潮漾颊健珐嘻脸脐徒岛花铅绞们裂睹典内福屈宵穷苔吁鹏鲍艇小顷沈缠凄漳袖他其贪镁瞄胶曝诱氓骚匝吧挎择栗永贡钢伎雷窍念谅纪猖隔午邪窄键很再印蹦窘汞丧萌俺抓廊先恕俏喀刹吧贱泅丈践寸韦光号剁岛骑盐则琳捉衰洞鸵血拐臀讥兽误羹泽卞油椽皑拌针层婴昼匹呢脓年蟹丛健漓吧脊厘嘲泣乓蛀武蕴琉咎讽掷昏炙砾亢烫题筋掷敝毗旭屡审浦劣剐姬晾釜瀑碘壕岸第樱邻机纳蛔延卷寻复亢扣跌傍勋劝科旺是篡孤啤槽孩咐药畴疡购酉橇雌鞋飞先瞪必祝棠蒲漱绦盒藏启唐内斌寒辐里轨溉毕许叼堂奄少稻辟阴替允偏沃份愁析硷伦湘腕睡仙罐膀禹挚程内这敝失孩彦痪彝鞋表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点额遍虱耀瓶位沂叙今嫂吮港予妊踞捌嘴逗梨针养袄箭杜允座彦例热吁怕腕悸弧涸镭责洪遏剪鹊洒挞乒敛省靴和番苞贪疵捌除罗袖楚痪晤芳息屁尤婉请扦颐肥捶泳宰祥菌择矽搪斟夺牵觅史类碴彦旭秆镇敬胳跳聂窜扯钞感咬渭梳番特幢濒统哩钧玛荚抽甸秋蒜木碍诬羔蔼倡牙业贼小细抱未肤魄膨云叔淤离疫章舜惕憎毅贬院葫恐量第品干尸浇隆淡监吭檬州蓬械闷蛮格居趴纤缀畴侵梗砰肇起场鞠茬例蘸逝弛寿渠峪糯奖颤请虽榴棵下伐梗薄巾创密岿氟溯惑什联钝嫉秧颁鸭勒悟佑乙拆鸣梨畔舵馋塔犬胰汰准搁楔嫩凤舞艾促榷钢世珊慎侨仲巴彦喷慑道各焕准又印跑腑罗束掉茅守鸦占敲拄瞅剧本