血红蛋白电泳的意义和判断.ppt

1.目的血红蛋白结构和功能的回顾SebiaCAPILLARYS2/Minicap血红蛋白检测说明血红蛋白临床结果说明2.血红蛋白的结构血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.Normalhemoglobins,containalpha,beta,delta,and gammaglobinchains.3.三维结构4亚单位2alpha链2alphagenes3非alpha链:beta,delta,gamma1 gene,1gene,2g genes4.正常结果HbA:22HbF:2g2HbA2:22+-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 Hydrasys(Sebia)碱性缓冲液碱性缓冲液成人成人新生儿新生儿5.血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES)?血红蛋白疾病血红蛋白疾病血红蛋白性质变化:血红蛋白分子病结构异常,一个或数个氨基酸变异或缺失,都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变常见血红蛋白变异体-globin:SCDPunjab E血红蛋白含量变化:地中海贫血地中海贫血合成或合成调控异常:globinThalassemiasglobinThalassemias合并型:血红蛋白分子病Hemoglobinopathies/地贫Thalassemias6.血红蛋白遗传病遗传性疾病基因学图谱正常基因异常基因7.异常血红蛋白类型目前,已经证实的有超过1000种以上的变异体(,g and)大部分变异体出现频率较低,并且没有明显临床症状4种主要变异体(HbS,HbC,HbEandHbDPunjab)出现频率较高(特定人群)携带者会出现健康问题儿童可能在出生时即伴随有严重症状8.血红蛋白疾病的区域分布图Thalassemias9.常见与地中海区域:意大利,西班牙,希腊,近东地区,非洲北部.同样常见于东南亚:泰国,印度,越南,中国,印尼.o临床症状*Beta地贫重症型-严重贫血(需要长期输血治疗)*Beta地贫中间型*Beta地贫轻微型-无临床症状Beta 地中海贫血o常见区域o 没有Beta链合成+合成能力下降10.Alpha 地中海贫血o临床症状:根据Alpha基因的表达状态,有4个不同程度的Alpha地贫症状*1个基因表达沉默:静止型(非常难检测到,在出生会测到HbBarts1-2%)*2个基因表达沉默:轻型alpha地贫,在出生会测到Barts2-10%*3个基因表达沉默:血红蛋白HbH病,出生时出现2-30%Barts,儿童-成人出现10-15%HbH*4个基因表达沉默:HbBarts胎儿水肿综合征(死胎)o常见区域常见与远东地区,非洲和地中海区国家11.其他特征其他特征Hb HHb A2Hb F贫血贫血小红细胞小红细胞靶细胞靶细胞异常异常出生时少量出生时少量的的(2%)Hb Barts0正常正常000一条链缺失出身时出身时Hb Barts(5%)0正常或减少正常0002条链缺失不稳定血红不稳定血红蛋白溶血性蛋白溶血性贫血贫血(Hb H)10-15%减少也许增加轻微的到严重的+3条链缺失胎儿水肿综胎儿水肿综合症合症(hydrops fetalis)00100%Hb Barts严重的-4条链缺失12.基因型基因型诊断诊断血常规血常规临床症状临床症状检测结果检测结果aa/aaaa/aa无HbA:NHbA2:N(2-3.5%)-a/aa-a/aa-Thalassaemia 2杂合体(静止型)轻微小红细胞症MCV:75-80fLMCH:20-24无HbAandHbA2:NHbBarts0-3%atbirthConfirmation by molecularbiology-a/-a-a/-a-Thalassaemia 2纯合体小红细胞症血红蛋白减少Hb:11-12g/dL无明显临床症状HbAandHbA2:NHbBarts2-8%atbirth-/aa-/aa-Thalassaemia 1杂合体MCV:65-75MCH:20-24需要分析序列分析或DNA序列分析-/-a-/-aHbH小红细胞症血红蛋白减少Hb:8-11g/dLMCV:55-65MCH:20-24出现溶血脾脏肿大HbA2NorHbBarts5%HbH10-20%-/-/-Thalassaemia 1纯合体(死胎)严重贫血水肿胎Hb:8-11g/dLMCV100-110MCH无法存活死胎AbsenceofHbAandHbFHbBarts80-100%HbPortland5%13.镰刀型红细胞血症变异体出现在6GAG(谷氨酸)GTG(缬氨酸)NSSASabnormal gene abnormal gene normal gene normal gene NHbSN NHbSASNHbAHbSN NSSHbAHbSChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Htrozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg gChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Heterozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg g14.C型血红蛋白分子病变异体位置:AA6:GAG(谷氨酸)AAG(Lys)HbAHeterozygoteACHbAHbCN NHbASCCompoundheterozygotyHbAHbCN NHbSHtrozygotecompositeACSCChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Htrozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg gChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1SCheterozygotecompoundChromosomes 11Heterozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg g15.D型血红蛋白分子病常见区域:常见于印度.特点:变异体位置121Glu(谷氨酸,负电荷)Gln(谷氨酰胺,不带电荷)(D-LosAngeles=D-Punjab)(6differentHbDaccordingtothepositionofthemutation)碱性缓冲液中:电荷下降M电泳速度变度变慢电泳速度变度变慢,靠近靠近Hb S临床症状:基因杂合体:无症状无症状(仅在电泳中发现仅在电泳中发现D D区带区带)HbAfraction:6570%HbDfraction:3035%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbDfraction:100%16.E型血红蛋白分子病常见区域:常见与东南亚地区.特点:变异位点26Glu(谷氨酸,负电荷)Lys(赖氨酸,正电荷)碱性缓冲液:总体带电荷下降凝胶电泳中凝胶电泳中,出现在出现在HbC附近附近临床症状:杂合体:无症状无症状HbAfraction:6570%HbEfraction:3035%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbEfraction:100%17.下列情况下,需要进行血红蛋白检测临床和遗传问题(产前诊断)贫血,小红细胞症 新生儿筛查对来自地贫高发区人口,进行筛查对诊断有帮助的其他信息患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景(输血记录)血液全套检测,网状细胞级别和进行细胞形态镜检 Hb电泳(EDTA抗凝管)离子平衡和溶血情况18.血红蛋白检测的几种方法目前,血红蛋白检测步骤如下:-电泳法对Hb进行检测或者使用等电聚焦电泳法-使用HPLC法进行确认.19.凝胶电泳结果识别表 20.在pH梯度的凝胶片上,根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离Hb电泳位置取决于缓冲液PH值蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动AtpI=pH,Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating电泳分离效果好,但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断等电聚焦电泳法21.介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法:-通过毛细管电泳法,即可以获得与IEF方法一样的分辨率,同时检测结果量值HbA2/HbF同样精确.-出现异常变异体后:使用下列方法确认:*ITANOtest(solubilitytest)*HPLC液相色谱*Genotyping基因筛查22.Capillarys2Capillarys2MinicapMinicap全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 Capillarys 2/Minicap23.毛细管电泳法原理毛细管电泳法原理 Peltier温控桥Anode+Cathode-检测器氘光灯电泳电泳高电压高电压24.此时此时,电渗力电渗力(EOF)(EOF)远远强于电场力远远强于电场力.因此因此,蛋白被动从正极向负极端移动蛋白被动从正极向负极端移动.正电极正电极正电极正电极 +EOFEOF负电极负电极负电极负电极-ElectroElectro migrationmigration蛋白电泳蛋白电泳DETECTIONDETECTIONINJECTIONINJECTION带正电荷的缓冲液带正电荷的缓冲液毛细管壁负离子鞘毛细管壁负离子鞘25.Capillarys/Minicap血红蛋白电泳血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程,然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来.正常质控品正常质控品必须在每天检测前使用Capillarys:-检测速度:40样品/小时-试管架1至7号位放置样品,8号位放4ml溶血素Minicap:-检测速度:10样品/小时-试管架1至26号位放置样品,27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素)26.Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求抗凝管采血(EDTA,heparin,citrate).如果需要对输血患者采血,需要在输血前采集血液.使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000rpm,5分钟离心后样品)+4C以上,标本最多存放7天.需要长期存放,可以洗涤红细胞后,放置于-80C(可存放至少3个月)27.CapillarysMinicap血红蛋白条带识别表Capillarys/Minicap区带识别表Z15:Z15:Hb HHb HZ14:/Z14:/Z13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ12:Z12:Hb BartsHb Barts,HbProvidenceHbJ-Mexico,HbJ-Baltimore.,HbProvidence,HbJ-Mexico,HbJ-Baltimore.Z11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ10:HbHope,HbM-IwateZ10:HbHope,HbM-IwateZ9:Z9:Hb AHb A,HbCamperdown,HbPhnomPenhHbCamperdown,HbPhnomPenhZ8:AcetylatedHbF,HbAltanta,HbAthens-GAZ8:AcetylatedHbFHbAltanta,HbAthens-GAZ7Z7:Hb FHb F,denaturatedHbS,HbPorto-Allegre.denaturatedHbS,HbPorto-Allegre.Z6:Z6:Hb D-PunjabHb D-Punjab,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbKHbK ln,denaturatedHbE.ln,denaturatedHbE.Z5:Z5:Hb SHb S,HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.,HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.Z4:Z4:Hb EHb E,denaturatedHbC,HbK,denaturatedHbC,HbK ln,HbA2variants,M-Iwateln,HbA2variants,M-IwateHbA2variantsHbA2variantsZ3:Z3:Hb A2Hb A2,HbO-ArabHbO-ArabZ2:Z2:Hb CHb C,HbConstantSpring,SetifHbA2variant,HbConstantSpring,SetifHbA2variantZ1:HbZ1:Hb A2HbA2Hb A2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variantA2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variant29.正常Hb A2 质控品条带结果可录为条带结果可录为QC30.Hb AFSC质控品,可用来作为参照曲线,便于异常结果的判断31.Hbs A,F,A2 检测结果可通过颜色进行区分 异常区带显示为灰色32.主要异常血红蛋白变异体Z15 HbHZ12 HbBartZ10 HbHopeZ9 Hb AZ7 Hb FZ6HbDPunjabZ5 Hb SZ4HbEZ3Hb A2Z2 Hb CHbEHbSHbH33.HbS 变异体,Hb A2 正常值 6 Glu ValHbA=22HbS=2S2HbA2=2234.Capillarys/Minicap血红蛋白试剂优势:无需前处理(不需要洗血和溶血)，直接检测血红蛋白C和E能从A2分离开根据S型和D型的细微电荷区别,进行区分.对于处于A和S之间的F给予个性化和聚焦的精确量化.对A2型血红蛋白有很好的分辨率和分离效果HbBarts和HbH可以很好的检测和量化糖化型血红蛋白电泳出现在主体峰内,不影响检测结果35.异常结果分析36.Case 2:31 Y Female,血红蛋白 12.8,红细胞压积 37.4 (I)A=84.1%F=1.5%A2=5.5%37.31 Y FemaleHgb 12.8,Hematocrit 37.4 (II)AlkAcidFSCA2CSF-thalassemia-轻型轻型A2AAAACPCPA=93.4%,F=1.1%,A2=5.5%38.Hb A 92.5%Hb F 2.6Hb A2 4.9%Hb FHb AHb A267 Y female from Tunisia,Hgb 9.1,hematocrit 28,MCV 62小红细胞症小红细胞症;beta thalassemia轻型轻型39.Hb H 4%Hb A 94.7%Hb A2 1.3%Hb AHb A2Hb HChild 9 Y,from Laos,Hgb 8,hematocrit 27.9,MCV 54.1严重小红细胞症严重小红细胞症;血红蛋白血红蛋白H病，需要基因筛查病，需要基因筛查40.Hb H and Barts-Alpha-thalassemiaHBarts41.Case 1:13 Y Male,Hgb 8.1,Hct 24.0 (I)A2=6.1%S=82.8%42.Case 1:13 Y Male,Hgb 8.1,Hematocrit 24.0 (II)AlkAcidFSCSA2+FCSFS Hgb F/S,A2=4.6%+beta thalassemia minorA2AFACPCP43.Case 2:65 Y Male,Hgb 9.4,Hematocrit 27.3 (I)Co-migration with A2A=62.1%A2=31.7%*44.Case 2:Hb E Migrates Separately From Hb A226 GluLys45.21Y,pregnant woman,Hgb 13.1,hematocrit 38.6Hb A 95%Hb F 2.1%Hb A2 2.9%Normal pattern,Hb F slightly increased(pregnancy)46.Baby 2 months old,father from Martinique,mother from Central Africa,Hgb 11,hematocrit 29.8Hb F 49.5%Hb S 25.9%Hb A2 1.8%Hb C 22.8%Hb FHb SHb A2Hb CSC compound heterozygoty47.Diabetic patient,54 Y,Hgb 14.5,hematocrit 43.5,MCV 88 HbA1cmeasurement(HPLCTosoh)Hb A 54.7%Hb X 41.7%Hb A2 3.6%Hb AHb A2Hb XNormal hemogram;compatible with heterozygote A/D;To be identified by genotyping48.Hb A 51.8%Hb A2 2.9%Hb C 35.9%Hb AHb A2Hb CDiabetic patient,61 Y,Hgb 11.6,hematocrit 34.8,MCV 85Slight anemia;compatible with heterozygote A/CTo be identified by genotyping 49.Adopted child,4 Y,originated from Haiti,Hgb 10.9,Hematocrit 31.3,MCV 76.9Hb A 97.5%Hb A2 1.4%Hb X 1.1%Hb AHb A2Hb XSlight anemia;heterozygous Delta mutation,asymptomatic50.Diabetic patient,73 Y,Hgb 10.2,hematocrit 30.8,MCV 87.3Alpha chain mutation;genotyping confirmation:Hb Winnipeg a a 75 Asp TyrHbA-WiHbA2-WiHbAHbA251.Hb A 90.3%Hb F 3.8%Hb A2 5.9%Hb AHb FHb A2Hb A 64%Hb S 33.1%Hb A2 2.9%Hb AHb SHb A2Hb A 2.2%Hb F 67.3%Hb S 29.1%Hb A2 1.4%Hb AHb FHb SHb A2Father:Beta thalassemia minor Mother:Heterozygote ASBaby 2 months old:Association S-beta thalassemia52.Hb Lepore on Minicap/CapillarysA AN NAlc.Alc.A A2 2LeporeLeporeN NAc.Ac.AA00+LeporeLeporeA A1 1HbA2HbAHbFHbLeporeAFSC control overlaying53.Hb Lepore和链重新组合形成.在碱性缓冲液下电泳:总体带电荷下降电泳位置出现在S型血红蛋白附近基因杂合体:HbLeporefraction:515%Clinicalsignsofminorthalassemia基因纯合体:HbLeporefraction:about30%Clinicalsignsofhomozygousthalassemia常见区域:Lepore(-Boston Washington):常见于意大利人群;同样常见于在罗马尼亚,澳大利亚和墨西哥人群.特点:54.a a47 AspHis47 AspHisHb HasharonHbAHbA2HbFHbHasharonHbHa-A2Hb O-ArabHb O-Arabb b121 GluLys121 GluLysHbA2+O-ArabHbFHbA56.DIAGNOSTIC FLOW-CHART57.58.现有的新生儿血红蛋白筛查方法(SCD)新生儿血红蛋白检测:*等电聚焦等电聚焦(IEF)*高效离子交换液相色谱法高效离子交换液相色谱法(CE-HPLC).毛细管电泳方法可取代常规,操作复杂的等电聚焦方法59.新生儿血红蛋白快速检测法取血板BSD600 全自动打孔器 全自动溶血,样品稀释和检测溶血剂样品条码识别：取血板条码样品稀释杯条码使用纯净水洗脱样品60.与IEF方法比较,毛细管方法优势对于常见异常血红蛋白变异体有对于常见异常血红蛋白变异体有100100区分能力区分能力 (Hb S,C,D,E)(Hb S,C,D,E)对其他非常见变异体有良好检测能力对其他非常见变异体有良好检测能力对不同类型样品拥有相同检测能力：新生儿对不同类型样品拥有相同检测能力：新生儿,早产儿或者进行过输血患早产儿或者进行过输血患儿样品儿样品全程检测溯源性全程检测溯源性:取血板和样品稀释杯使用条码取血板和样品稀释杯使用条码高效性高效性(48(48个样品个样品/小时小时),576),576样品样品/天天4 4小时人机分离操作小时人机分离操作,最多可进行最多可进行3X1923X192个样品检测个样品检测可选择使用与毛细管匹配的全自动打孔机可选择使用与毛细管匹配的全自动打孔机,完全自动化处理样品完全自动化处理样品无需人工进行样品转移无需人工进行样品转移,避免交叉污染避免交叉污染该项目检测完全自动化该项目检测完全自动化:从前处理到检测从前处理到检测,直到结果分析直到结果分析,全程无需人工全程无需人工干预干预.61.使用标准取血板,在室温下进行干燥.干燥的取血板可在2-8C下,保存1个月.新生儿血红蛋白检测的样品要求通过颜色区分正常及异常样品正常血样:withHbFandHbA(+acetylatedHbF)异常血样63.提供样品检测完整溯源性通过样品ID,试剂杯和全自动打孔器的数据记录完成数据交换异常样品自动显示64.电泳图谱说明:*检测到条带的位置,图谱会自动定位*鼠标经过的区带位置,会显示出该区带的所有可能出现的异常血红蛋白名称.(N1toN13).新生儿血红蛋白检测条带名称识别表N 13:HbBartsN 12:/N 11:HbHope,Gammachainvariants,denaturedHbAN 10:HbAN 9:DenaturedHbFN 8:/N 7:HbFN 6:/N 5:HbD-Punjab,HbG-Philadelphia,HbKorle-BuN 4:HbS,acetylatedgammachainvariantsN 3:HbE,HbF-OuledRabah,gammachainvariants,MethemoglobinN 2:HbA2,HbO-Arab,HbF-OuledRabah,gammachainvariantsN 1:HbC66.正常血样HbFHbABirth:19/01/06Samplecollection:24/01/06Term:39w.Weight:3445g67.输血后检测结果Birth:29/01/06Samplecollection:01/02/06Term:38w.Weight:3100g68.F/S homozygoteBirth:05/01/06Samplecollection:08/01/06Term:37w.Weight:3490gHbSHbFDenaturedHbF69.早产儿体内的F/SDenaturedHbFHbFHbSBirth:20/02/06Samplecollection:23/02/06Term:34w.Weight:1300g70.F/SC compound heterozygoteDenaturedHbFHbFHbSHbCBirth:30/01/06Samplecollection:02/02/06Term:40w.Weight:3900g71.F/AS heterozygoteHbAHbFHbSBirth:16/12/06Samplecollection:19/12/06Term:36w.Weight:2780g72.F/C homozygoteHbFHbCDenaturedHbFBirth:20/12/05Samplecollection:24/12/05Term:39w.Weight:3160g73.F/AC heterozygoteBirth:18/12/06Samplecollection:21/12/06Term:40w.Weight:3035g74.F/AC in a premature newbornBirth:17/10/05Samplecollection:20/10/05Term:30w.Weight:2330g75.F/AD heterozygoteBirth:29/01/06Samplecollection31/01/06Term:37w.Weight:3280g76.F/E homozygoteHbEHbFDenaturedHbFBirth:10/11/06Samplecollection:13/11/06Term:40w.Weight:?77.F/AE heterozygote Birth:10/03/06Samplecollection:13/03/06Term:39w.Weight:3420g78.F/AE in a premature newbornBirth:21/07/05Samplecollection:24/07/05Term:35w.Weight:1840g79.F/A0-Arab heterozygoteBirth:14/02/06Samplecollection:17/02/06Term:40w.Weight:3120g80.F/AKorle-Bu heterozygote:Birth:31/10/06Samplecollection:03/11/06Term:40w.Weight:3790g81.Barts in a term newbornBirth:05/04/06Samplecollection:08/04/06Term:38w.Weight:2790g82.对新生儿血红蛋白的定量检测83.AF controlHbAHbFHbA2Hb quantification84.Normal bloodHbAHbFHb quantificationRatio A/F85.F/AS heterozygoteHbAHbFHb quantificationHbSRatio A/S86.F/AC heterozygoteHbAHbFRatio A/CHbCHb quantification87.Hb Barts in a newbornHbAHbFHb quantificationHbBarts88.特定程序下使用普通血红蛋白试剂盒89.CORD BLOOD:normal sample90.CORD BLOOD:a a-Thalassemia91.CORD BLOOD:Heterozygote A/D-Punjab92.CORD BLOOD:Heterozygote A/S93.总结血红蛋白疾病:CAPILLARYS新生儿和脐带血血红蛋白检测可作为等电聚焦方法和液相色谱法的替代技术如需对特殊检测结果进行确认,可选择其他方法(液相色谱,基因筛查)94.Thank you for your attention95.