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乳铁蛋白的分离工艺研究
牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高10～100倍。这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。
    乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。LF的一级结构是一条多肽链，分子量为70～80kD，LF上结合有两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N－乙酰半乳糖胺藻糖等。LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。
    在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml，比常乳高近50倍。我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。
1 原料与器材
1.1 原料与试剂
    牛初乳：乳牛产犊3ｄ内收集的样品，CM-Sephadex C-50：进口分装BMK（Shanghai）Sci & Tech Ltd，CM-SEPHAROSE FAST FLOW，LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺Bis、分析纯Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），化学纯SDS（十二烷基磺酸钠），分析纯TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸胺Ap，分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝R-250等。
1.2 实验仪器
    SBS-100数控计滴自动部分收集器、HD-21-88核酸蛋白检测仪、3057 PORTABLE RECORDER、BT01-100兰格恒流泵、TH-500梯度混合器、PHS-25型pH计、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、DYⅢ 28A型电泳槽、751G分光光度计、TDL-5000B冷冻离心机。
2 实验方法
2.1 分离方法
2.1.1 凝胶的预处理
    取液体胶与去离子水1：1混合，浸泡，沉降装柱。以2BV的流速先用碱洗2.5h（5倍胶体积），用去离子水洗至pH值为7.0左右，用酸洗2.5h，用水洗至pH值为7.0左右，再用碱洗2.5h，后用水洗至pH值7.0左右备用。
2.1.2 牛初乳的脱脂
    取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心30min（4 800r/min，1～5℃），去上层油脂。
2.1.3 阶跃洗脱的方法

    在4℃条件下动态上柱吸附8h。去离子水以1BV的流速洗柱约10h，待基线走平，用1.6%NaCl洗脱约需5h，期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用5.0%NaCl洗脱，洗脱产物为LF（粉红色），出峰时间为1h左右。洗脱曲线见图1。
2.1.4 CM-SEPHAROSE FAST FLOW的穿透曲线（图2）

    在实验中利用纯度为97%标准样品配制浓度为4.80g/l的LF溶液，在约5BV流速下测定胶体积为62ml的CM-SEPHAROSE FAST FLOW的穿透曲线。根据洗脱记录可计算得到在穿透点到达前，CM-SEPHAROSE FAST FLOW的实际吸附容量为2g左右。
2.1.5 透析
    取洗脱液于透析袋，放在蒸馏水中24h，中间每8h换一次水，除去洗脱液中的盐类小分子。
2.1.6 干燥
    冷冻干燥法，此法对乳铁蛋白的生物活性损失小。
2.2 分析方法
2.2.1 蛋白质测定
    用核酸蛋白检测仪测定蛋白质。
2.22 乳铁蛋白纯度的分析
    用HPLC法和凝胶电泳法进行纯度分析。
3 结果与分析
3.1 交换剂的选择
    根据乳铁蛋白的特性，本实验选用弱酸性阳离子交换剂，并选用Na型交换剂作为贮存、吸附时的离子型。比较了CM-SEPHADEX C-50和CM-SEPHAROSE FAST FLOW 2种树脂的分离效果。

    从表1可以看出，相同单位量的牛初乳原料进行实验，CM-SEPHADEX C-50和CM-SEPHAROSE FAST FLOW相比，洗脱得到的LF的量和纯度都相差不大，只是CM-SEPHADEX C-50得到的洗脱液呈较深粉红色，而用CM-SEPHAROSE FAST FLOW洗脱得到的洗脱液颜色略浅一些。
    使用相同的装柱方法时，CM-SEPHAROSE FAST FLOW比CM-SEPHADEX C-50更容易操作，且在实验过程中体积不会发生变化，有利于实现工业化生产。同时由于装柱过程对洗脱效果也有相当程度的影响，故后继实验选用CM-SEPHAROSE FAST FLOW为交换剂。
3.2 吸附方法的选择（见图3）

    离子交换色谱的吸附方法主要分为静态吸附与动态吸附2类。静态吸附需要的时间比较少，但是无法实现连续操作，只能停留在实验室小规模提取阶段，缺乏工业化生产的可能性。而动态吸附比较容易实现产业化，需要的时间一般随原料的量而变化。
2种吸附方法在后期的pH值基本保持稳定，说明牛初乳具有良好的缓冲功能。由于静态吸附后的吸附剂难于装柱，故选用动态吸附法。
3.3 吸附速度的选择
    由于在工业化生产中为了提高生产效率，必然在不影响产品得率的前提下降低生产周期。而牛初乳的上柱吸附时间在整个生产环节中占了很大的一个比例。尽可能的提高牛初乳的吸附速度成为工业化生产的必然选择。由于吸附速度受牛初乳的理化性质及离子交换柱的径高比等因素的影响，本实验只在现有条件下比较了3种不同吸附速度的效果比较。
从表2我们可以看出3BV和5BV两个吸附速度的产品得率相差不大，7BV的收率偏低，估计已超过穿透速率。故选用5BV的吸附速度。

3.4 洗脱方法的选择
    洗脱方法中，最常用的是阶跃洗脱与梯度洗脱法。2组梯度洗脱实验，分别使用5%NaCl以及10%NaCl的浓缩液，稀释液均为去离子水。

    表3中可以看出，阶跃洗脱的效果要好于梯度洗脱。从洗脱曲线上（见图4、图5）可以看出，梯度洗脱的梯度没有掌握好，峰都重叠在了一起，没有达到要求的分离度。可能是梯度太小，从而流动相的浓度增大，速度太小，峰型过宽，影响了最终的分离度。从洗脱曲线上也可看出，随着梯度洗脱的梯度的增大，峰型变得窄一些和陡一些，洗脱效果也有所提高。
3.5 产品的透析和冻干（见图6、图7）
    洗脱液经透析24h后冷冻干燥，得LF固态产品。

4 结论
    本文主要对牛初乳中乳铁蛋白LF分离纯化的工艺进行了研究，并对其工艺流程实现了优化。得到最佳洗脱工艺：使用CM－SAPHAROSE FAST FLOW装柱，再转化为Na型，然后用脱脂牛初乳作为原料，用200目滤布过滤后，在4℃下以5BV动态吸附上柱。吸附完毕后，先用去离子水以1BV的流速洗柱，约10h，待基线走平，然后用1.6%NaCl以1BV的流速洗脱，约需5h，期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用5.0%NaCl以1BV的流速洗脱，洗脱产物为LF（粉红色溶液），出峰时间为1h左右，洗脱液经透析后冷冻干燥得LF产品，纯度达到95%以上。其中专业理论知识内容包括：保安理论知识、消防业务知识、职业道德、法律常识、保安礼仪、救护知识。作技能训练内容包括：岗位操作指引、勤务技能、消防技能、军事技能。
二．培训的及要求培训目的
安全生产目标责任书
为了进一步落实安全生产责任制，做到“责、权、利”相结合，根据我公司2015年度安全生产目标的内容，现与财务部签订如下安全生产目标：
一、目标值：
1、全年人身死亡事故为零，重伤事故为零，轻伤人数为零。
2、现金安全保管，不发生盗窃事故。

3、每月足额提取安全生产费用，保障安全生产投入资金的到位。
4、安全培训合格率为100%。
二、本单位安全工作上必须做到以下内容：
1、对本单位的安全生产负直接领导责任，必须模范遵守公司的各项安全管理制度，不发布与公司安全管理制度相抵触的指令，严格履行本人的安全职责，确保安全责任制在本单位全面落实，并全力支持安全工作。
2、保证公司各项安全管理制度和管理办法在本单位内全面实施，并自觉接受公司安全部门的监督和管理。
3、在确保安全的前提下组织生产，始终把安全工作放在首位，当“安全与交货期、质量”发生矛盾时，坚持安全第一的原则。
4、参加生产碰头会时，首先汇报本单位的安全生产情况和安全问题落实情况；在安排本单位生产任务时，必须安排安全工作内容，并写入记录。
5、在公司及政府的安全检查中杜绝各类违章现象。
6、组织本部门积极参加安全检查，做到有检查、有整改，记录全。
7、以身作则，不违章指挥、不违章操作。对发现的各类违章现象负有查禁的责任，同时要予以查处。
8、虚心接受员工提出的问题，杜绝不接受或盲目指挥；
9、发生事故，应立即报告主管领导，按照“四不放过”的原则召开事故分析会，提出整改措施和对责任者的处理意见，并填写事故登记表，严禁隐瞒不报或降低对责任者的处罚标准。
10、必须按规定对单位员工进行培训和新员工上岗教育；
11、严格执行公司安全生产十六项禁令，保证本单位所有人员不违章作业。
三、 安全奖惩：
1、对于全年实现安全目标的按照公司生产现场管理规定和工作说明书进行考核奖励；对于未实现安全目标的按照公司规定进行处罚。
2、每月接受主管领导指派人员对安全生产责任状的落