凝聚胺法交叉配血试验.doc

HSXZ/QMXCXD/ SOP-004（QMXYY/SXK/ SOP-004） 第 6 页 共 6 页
凝聚胺法交叉配血试验操作规程

[目的]
保证交叉配血试验准确，确保临床输血安全。
[适用范围]
XXX医院输血科
[职责]
具有专业技术的工作人员主要负责XXX医院输血标本的交叉配血试验，但只对该单份标本负责。
[相关文件]
试剂采购、保存和使用管理程序
设备采购、使用管理程序
消毒与清洁管理程序
标本采集、运输、保存和报废管理程序
紧急用血管理程序
[相关记录]
仪器设备的采购、使用和维护记录
仪器的温度记录
恒温水温箱的换水和消毒记录
消毒液的配置记录
清洁消毒记录
试剂采购、使用记录
标本交接和报废记录
交叉配血记录
紧急用血记录
[实验原理]
　　红细胞表面带有大量的负电荷，以避免产生自发性聚集，当红细胞悬浮在电解质中时，阳离子会被红细胞的负电荷所吸引，此时红细胞则被扩散的双层离子云所围绕而形成Zeta电位，Zeta电位决定红细胞之间的排斥作用。
凝聚胺技术首先利用低离子溶液（LIM）降低介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，以促进红细胞与血清（血浆）中的抗体结合。其次加入的凝聚胺（Polybrene）溶液是一种高价阳离子多聚物、肝素中和剂，溶解后能产生很多正电荷，可以中和红细胞表面带有的负电荷，使红细胞的Zeta电位降低，缩短红细胞之间的距离，使红细胞产生非特异性的凝集。最后加入的悬浮液（Resuspending）具有中和凝聚胺（Polybrene）阳离子的作用，使正常的红细胞非特异性凝集散开，试验结果为阴性；但如果红细胞被相应的抗体致敏，则会被凝聚胺凝集而不会散开，试验结果为阳性。
[仪器器械]
　　玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、交叉配血专用离心机、试管架恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。
[试剂]
生理盐水、凝聚胺试剂、Anti-human IgG血清，均为有合格证件的正品。
[试剂保存和稳定性]
1． 凝聚胺试剂须保存在2-25℃（其中阴、阳对照血清应储存在2~8℃）。在适当储存条件下有效期24个月。
2． 抗人IgG血清低温冰箱保存。复溶后放2—4℃冰箱保存。
3． 凝聚胺试剂
①低离子介质溶液（LIM）：含葡萄糖，乙二胺四醋酸-2钠及稳定剂。
②凝聚胺溶液（Polybrene）：含凝聚胺，氯化钠及稳定剂。
③复悬液（Resuspending）：含柠檬酸钠，葡萄糖及稳定剂。
④阳性对照血清：含抗D血清、氯化钠及稳定剂。
⑤阴性对照血清：含AB血浆、氯化钠及稳定剂，不含红细胞血型抗体。
[标本收集与处理]
1、受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。
2、2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，先用生理盐水洗涤红细胞3次，再根据下表进行红细胞悬液的配制。
悬液浓度（%）
压积红细胞（滴）
盐水（滴）
2
1
40(2ml)
5
1
16 (0.8ml)
3、以上标本有效期为三天；若受血者抽取标本后，输用过血液或血液制品，且输用时间超过12 小时的，必须重新采集标本。
4、标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。
[实验方法与步骤]
1、分别制备受血者和献血者3~5%的红细胞悬液（取2支使管分别标注为受血者管和献血者管，再分别加入2ml生理盐水，在受血者管加入1滴受血者红细胞，在献血者管加入1滴献血者红细胞，混匀后备用）。
2、取4支使管，分别标注主侧、次侧、阴性对照和阳性对照：
主侧管：先加入2滴受血者血清（血浆），再加入1滴献血者2~5%红细胞悬液；
次侧管：先加入2滴献血者血清（血浆），再加入1滴受血者2~5%红细胞悬液；
阴性对照管：先加入2滴阴性对照血清，再加入1滴献血者2~5%红细胞悬液；阳性对照管：先加入2滴阳性对照血清，再加入1滴献血者2~5%红细胞悬液。
3、混匀后各加入LIM溶液0.65ml，轻轻混匀，于室温下静置1分钟。
4、再各加入2滴Polybrene溶液，轻轻混匀，于室温下静置15秒。
5、用交叉配血专用离心机3400 r/min（相当于1000g离心力）离心10秒，然后倒掉上清液（不要沥干），让管底残留约0.1 ml液体。
6、轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。重做后仍然没有凝集现象出现，可能试剂失效。
7、最后各加入2滴Resuspending溶液，轻轻摇动试管并同时目测凝集是否散开，再进一步倒在玻片上用显微镜观察凝集是否散开。如果在60秒内凝集散开，表明是由Polybrene引起的非特异性凝集，配血结果相合；如果凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血结果不相合。
如果想进一步检测Anti-K抗体，则必须继续做辅助性的抗球蛋白试验，步骤如下：
8、再滴入1滴Resuspending溶液。
9、用生理盐水洗红细胞3—5次，并把最后一次上清液完全倒干。
10、滴入2滴Anti-human IgG血清，并混匀。
11、用交叉配血专用离心机3400rpm离心15s.
12、观察有无凝集反应，如果有凝集反应，表示有Anti-K抗体，则必须进一步做抗体冲出试验，供血者的血液不适合病人使用。如果没有凝集反应，为了确保输血的安全性，须再各添加1滴已知致敏性红细胞至所有没有凝集的试管中，混匀，3400rpm离心1分钟。正常应有2+反应。如果没有凝集反应，可能是假阴性，辅助性抗球蛋白试验必须重做。
[结果判断]
1、ABO同型配血，主侧和次侧均无溶血及凝集表示无输血禁忌，可以输血。
2、如急需输血但一时无同型血液，作异型配血时（指O型血输给A，B或AB型，或A，B型血输给AB型时），主侧无溶血及凝集，但次侧必然有凝集或溶血。
[质量控制与注意事项]
1、在进行交叉配血试验时，一定要严格按操作规程进行，每进行一步操作，必须进行一次核对，防止操作错误，尤其防止主侧和次侧加样加错。操作方法应按规定先加血清，然后再加红细胞悬液，以便核实是否漏加血清。同时注意区别凝聚胺所引起的凝集反应。
2、受血者标本有效期为三天；若受血者抽取标本后，输用过血液或血液制品，且输用时间超过12 小时的，必须重新采集标本。2~5%红细胞悬液要求准确，必要时用生理盐水洗涤红细胞后重新配制。
3、如果主侧发生凝集反应，说明配血不合，不论次侧配血如何都不能输血。如果仅次侧配血发生凝集反应，只有在紧急情况下才有可能考虑是否输血。
4、可以用EDTA抗凝血浆代替血清使用，不能使用溶血标本及含有枸橼酸钠、肝素的抗凝血浆标本。
5、加Polybrene溶液离心去上清后不凝集，可能是标本中含有肝素或其它干扰因子。若病人血清(血浆)含有肝素或其它干扰因子，如洗肾患者，需多加4~6滴Polybrene溶液以中和肝素或其它干扰因子。
6、红细胞悬液以3~5％为宜，过浓或过淡可使抗原抗体比例不适当，反应不明显而易误判。
7、未开封的试剂应储存于温度在2~25℃、相对湿度不大于80%、无腐蚀性气体的环境中；已开封的试剂应储存于相对湿度不大于80%、无腐蚀性气体和通风良好的室温环境中；试剂用后应及时拧紧瓶盖保存；未开封试剂的有效期为两年，在有效期内已开封的试剂应在开封后的6个月内使用完。
8、试管，滴管吸头和玻片必须清洁干燥，防止溶血。
9、离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。
10、各种原因引起的红细胞溶解，易误判为不凝集，部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体。
11、中国人极少有Anti-K抗体，但其他人种比例较高，尤其是白种人，所以，当病人是其他人种时，为求安全起见，应加做辅助性抗球蛋白试验。加做辅助性抗球蛋白试验是为了增加检测Anti-K抗体的敏感度，对检测其他的抗体无帮助。所以，除非想进一步检测Anti-K抗体，否则不须做到辅助性抗球蛋白试验。
12、进行交叉配血前逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型（正、反定型），并常规检查患者Rh（D）血型，正确无误时可进行交叉配血。
13、结果判断必须先肉眼观察，再进行显微镜观察。注意观察弱凝集和排除非特异性凝集。
14、交叉配血试验中发现有不配合时，首先应考虑受血者和供血者的ABO血型和Rh(D)血型定型是否错误，必要时进行抗体筛检。其次，应注意有无特异性同种抗体，特异性未知的同种抗体存在，或者患者的血清在室温37℃或抗球蛋白血清中凝集所有的其他红细胞，造成交叉配血的困难，应进一步作有关试验进行鉴定。
15、两人值班时，交叉配血试验由两人互相核对；一人值班时，操作完毕后自己复核，并填写配血试验结果。（按“交叉配血核对制度”进行）。
16、各供血者间需进行交叉配血；已经输注的血液不足24 小时的，供血者间也需进行交叉配血。
17、凝聚胺试剂还可用于辅助抗体筛检试验、辅助性抗人球蛋白试验和辅助性血型鉴定。具体操作方法详见凝聚胺试剂盒使用说明书。
18、判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。
[交叉配血的影响因素及解决方法]
准确的交叉配血是临床安全有效输血的最后一条重要保证。输血配合是选择适合受血者输注的血液，使输血的成分能在受血者体内有效存活，并且无不良反应，即输入的红细胞在受者体内必须不凝集和不溶血，输入的血浆成分不导致受者自身红细胞显著破坏，使受血者恢复健康。影响交叉配血的因素很多，主要如下：
1、标本
①血标本的采集错误、稀释和溶血。另从受检者采集l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不合。标本一般要求离体后尽快实验，最长不能超过3天，每次输血后受血者和供血者的血标本应在2～8℃保存7天。
②患者的药物使用有时也对实验有一定影响，当受血者使用肝素治疗时，应使用硫酸鱼精蛋白对抗使标本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治疗，应注意将红细胞洗涤。
③受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤)，以及类B或cisAB等。●如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗—A或抗—B血清做吸收及放散试验，以及用受检者唾液作A、B、H血型物质测定（只对80％HAB分泌型的人有用）。●如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别：(1) 观察细胞与抗—A及抗—B的凝集强度，与抗—A的反应要比与抗—B的反应强，这种区别用玻片法作试验更为明显；(2) 用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗—B不凝集自身红细胞上的类B抗原；(3) 检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质；(4) 核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。
④受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症)，或实验时温度过高，常引起红胞呈缗钱状排列。如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水l滴。混和，往往可使缗钱现象消失。注意不应先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞做试验，以免使血清中抗体被稀释。
⑤细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。多凝集红细胞具有以下特点：(1)能被人和许多家兔的血清凝集；(2)能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。(3)不被脐带血清凝集。(4)通常不与自身的血清凝集。(5)如有条件可用外源凝集素加以鉴别。
⑥检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗—B抗体，如丙种球蛋白缺乏症，老年人血清中抗体水平大幅度下降等。如果试验结果未见凝集，应将细胞及血清试验至少在室温和4℃放置30min，用显微镜检查核实。
⑦血清中有意外抗体，如自身抗—I，常引起干扰。用A1、A2、B、O红细胞及自身红细胞检查受检者血清。如果怀疑是抗—I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。
⑧各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体。将红细胞洗涤数次，配成2~5%生理盐水细胞悬液，用抗—A、抗—B、抗—Al，抗—A十B及抗H做试验可以得到其它有用的信息。对受检红细胞作直接抗球蛋白试验，如结果呈阳性，表示红细胞已被抗体致敏。
2、试剂
①运输、贮存等条件不适可导致试剂变质失效，造成配血错误。实验前进行试剂外观、效价等项目质量控制。②不同抗凝剂制备的标准红细胞质量也不同；另外，红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，易误判为阴性反应。应依据要求正确配制红细胞浓度。③启用生理盐水时，应及时贴上启用时间；超期的试剂要及时更换。使用过程中，怀疑试剂污染时或配血结果可疑时，必须更换试剂。
3、冷凝集素
在ABO血型鉴定和交叉配血的过程中，冷凝集素是影响ABO血型正反不符和交叉配血不合的常见原因，尤其是在冬天气温较低时，某些病人血清中含有冷凝集素而导致出现假阳性。正常人血清中冷凝集素效价一般不高，且在4℃以下时才有活性。但由于人免疫系统的差异，在恶性肿瘤或病原体感染后有时冷反应性自身抗体可异常增高，造成溶血性贫血。这种冷凝集素效价在4℃可高于1000，用37℃生理盐水洗涤红细胞，操作时再置于37℃水浴中轻轻摇动可以排除冷凝集素的干扰。
4、自身免疫性溶血性贫血
红细胞被自身抗体强烈致敏后将干扰ABO定型，且自身抗体的存在会导致交叉配血不合，选择合适的试验方法对红细胞上结合的抗体做放散处理，确定抗体的特异性。如果抗体属于同种抗体，则交叉配血时应选取该抗原阴性的献血者的血液。如果该抗体无法确定特异性，则交叉配血时要根据患者自身红细胞与自身血清的对照反应选取较弱反应的献血者血液，因为自身抗体的干扰而发生ABO正反定型不相符时，可用37℃～45℃生理盐水洗涤红细胞三次，或者用放散后的红细胞（放散方法需不破坏红细胞结构），血清定型则可用洗涤或放散后的红细胞将血清中的自身抗体吸收后再进行。
5、弱凝集
血型试验是抗原抗体反应，当患者红细胞上抗原异常或血清中存在ABO血型以外的不规则抗体时，可能会导致减弱的或缺少的凝集反应。抗原异常包括：①亚型，这种亚型红细胞抗原性较弱，可以通过亚型定型试剂来具体定型。②红细胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生儿、老年人及少数恶病质患者。鉴定血型时要注意正反定型的结合，加用抗H和抗A，B型标准血清、A2红细胞等检查唾液中的血型物质，必要时作吸收放散试验以确定。若血清中存在不规则抗体可在反定型用O细胞加以鉴定，有些亚型因为抗原的某些位点缺失，也会产生相对于缺失抗原位点的抗体，这些抗体的产生有助于亚型的判定。
6、细菌性凝集
常见有类B凝集，A型或O型病人因大肠杆菌O86感染，从而使红细胞上获得类B抗原，能与抗B抗体发生凝集，表现为B 或AB型。其不受温度影响，病情好转类B凝集即消失。另外红细胞被细菌或细菌酶污染，红细胞上的T抗原被激活，与供血者中抗T抗体发生凝集。此种凝集在4℃和37℃之间随着温度的升高凝集程度逐渐减弱，在37℃时最弱或消失。
7、混合外观凝集现象
出现混合外观凝集的情况时一般要核对标本，必要时可重新抽取血样。患者在近期有过骨髓移植或输血史、胎盘出血和白血病等应在疾病恢复后再确定血型。其他原因如嵌合现象、A3亚型及Tn多凝集反应等在定型时可帮助正确判断血型。
8、不规则抗体及亚型
血型试验是抗原抗体反应，当患者血清中存在ABO型以外的IgM或IgG和IgM混合型不规则抗体时，必然会导致ABO正反定型不一致。可通过测定唾液中的血型物质来鉴定ABO血型。由于受检者红细胞上有弱抗原，且抗原表达性特别弱，在纸片定型中很可能被错误定型，另外抗A/抗B/抗AB血清的效价低或Ac/Bc/Oc等其他因素的影响，正反定型不相符，也可能被错定或无法确认，应用试管盐水法镜检显示抗-A/抗-B/抗-AB管呈弱的混合外观，正反定型相符，且经吸收放散试验进一步确定相应的亚型。由于某些亚型红细胞与抗A，B血清呈现出特异性反应，因此同时采用抗A，B血清，而在反定型时加入O细胞可以检出部分不规则抗体。对ABO血型正反定型不一致的标本，正定型时加入抗-H有助于检测红细胞表面H抗原的量，对鉴别亚型具有重要意义，同时有助于发现稀有血型，如孟买型等。
9、假凝集
血清在室温和37℃中，使红细胞出现了假凝集，造成配血错误。常见于某些肝病、传染病、多发性骨髓瘤、霍金氏病、心肌梗塞、感染等病，或用纸片或玻片作血型鉴定时，时间过长水份蒸发引起红细胞发生凝集，这种凝集在镜下为缗钱状，可看清红细胞形态，患者红细胞直接抗人球蛋白试验阴性，用生理盐水稀释或洗涤红细胞可使凝集消失。

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