分子生物学常用技术(简化版).ppt

z第第第第1919章：分子生物学常用技术章：分子生物学常用技术章：分子生物学常用技术章：分子生物学常用技术4 4学时学时学时学时y分子杂交、分子杂交、分子杂交、分子杂交、PCRPCR、基因测序、基因测序、基因测序、基因测序y蛋白质研究技术蛋白质研究技术蛋白质研究技术蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交双向电泳，酵母双杂交双向电泳，酵母双杂交双向电泳，酵母双杂交)y基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除(含含含含RNARNA干扰干扰干扰干扰)z第第第第2020章：基因工程章：基因工程章：基因工程章：基因工程4 4学时学时学时学时z第第第第2121章：基因诊断与基因治疗章：基因诊断与基因治疗章：基因诊断与基因治疗章：基因诊断与基因治疗4 4学时学时学时学时第四篇：分子生物学技术与应用第四篇：分子生物学技术与应用第十九章第十九章分子生物学常用技术分子生物学常用技术分子生物学技术能帮助我们干什么？分子生物学技术能帮助我们干什么？z揭示生物大分子揭示生物大分子揭示生物大分子揭示生物大分子(DNA(DNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质)的结构与功能的结构与功能的结构与功能的结构与功能yDNADNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位yRNARNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析分析分析分析y蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能水平：蛋白质定量、定位、功能水平：蛋白质定量、定位、功能水平：蛋白质定量、定位、功能y细胞细胞细胞细胞与与与与整体整体整体整体水平：基因在活体中的功能水平：基因在活体中的功能水平：基因在活体中的功能水平：基因在活体中的功能z目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段我们需要了解和掌握哪些基本技术？我们需要了解和掌握哪些基本技术？z基本技术：基本技术：基本技术：基本技术：y核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术y蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用z综合技术：综合技术：综合技术：综合技术：y基因工程技术基因工程技术基因工程技术基因工程技术y转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术z应用技术：应用技术：应用技术：应用技术：y基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断y基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗zMolecular hybridizationMolecular hybridization:利用已知核酸序列利用已知核酸序列利用已知核酸序列利用已知核酸序列 (探针探针探针探针/probeprobe)检测与其互补的检测与其互补的检测与其互补的检测与其互补的未知核酸序列未知核酸序列未知核酸序列未知核酸序列z用途：用途：用途：用途：y确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性y对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量y自核酸混合体中辨认特定核酸序列自核酸混合体中辨认特定核酸序列自核酸混合体中辨认特定核酸序列自核酸混合体中辨认特定核酸序列第一节：核酸分子杂交第一节：核酸分子杂交一、基本原理一、基本原理 变性变性变性变性(denaturedenature)复性复性复性复性(renaturerenature)杂交杂交杂交杂交(hybiridizationhybiridization)核酸核酸变性变性z在特定变性因素作用下，在特定变性因素作用下，在特定变性因素作用下，在特定变性因素作用下，DNADNA双螺旋解离的过程双螺旋解离的过程双螺旋解离的过程双螺旋解离的过程z破坏氢键与疏水作用可导致变性破坏氢键与疏水作用可导致变性破坏氢键与疏水作用可导致变性破坏氢键与疏水作用可导致变性热变性：热变性：热变性：热变性：高温高温高温高温可使核酸变性，温度高于可使核酸变性，温度高于可使核酸变性，温度高于可使核酸变性，温度高于 9090时任时任时任时任何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性酸碱变性：酸碱变性：酸碱变性：酸碱变性：pH3 pH11 pH11 时核酸将变性，时核酸将变性，时核酸将变性，时核酸将变性，DNA DNA 使用碱变性使用碱变性使用碱变性使用碱变性，RNA RNA 则不可则不可则不可则不可化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素尿素尿素尿素或或或或甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺可使核酸变性可使核酸变性可使核酸变性可使核酸变性变性温度变性温度zzTmTm：melting temperaturemelting temperature，解链温度或变性温度，解链温度或变性温度，解链温度或变性温度，解链温度或变性温度zz影响变性温度的因素：影响变性温度的因素：影响变性温度的因素：影响变性温度的因素：yy溶液的离子强度溶液的离子强度溶液的离子强度溶液的离子强度xx变性温度与离子强度变性温度与离子强度变性温度与离子强度变性温度与离子强度 正相关，低盐利于变性正相关，低盐利于变性正相关，低盐利于变性正相关，低盐利于变性yyDNADNA分子的分子的分子的分子的 GC GC 含量含量含量含量xxGCGC(Tm(Tm69.3)2.2469.3)2.24核酸复核酸复性性z变性的变性的变性的变性的 DNA DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双单链相互识别并结合，恢复其天然双单链相互识别并结合，恢复其天然双单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构的过程螺旋结构的过程螺旋结构的过程螺旋结构的过程z复性类似与化学反应，需要一定反应时间复性类似与化学反应，需要一定反应时间复性类似与化学反应，需要一定反应时间复性类似与化学反应，需要一定反应时间影响影响 DNA 复性速度的因素复性速度的因素zDNA DNA 分子的浓度：浓度高，复性快分子的浓度：浓度高，复性快分子的浓度：浓度高，复性快分子的浓度：浓度高，复性快zDNA DNA 分子的长度：长片段复性速度慢分子的长度：长片段复性速度慢分子的长度：长片段复性速度慢分子的长度：长片段复性速度慢zDNA DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快分子的复杂性：重复序列复性速度快分子的复杂性：重复序列复性速度快分子的复杂性：重复序列复性速度快 不同物种不同物种不同物种不同物种C C0 0t t曲线比较曲线比较曲线比较曲线比较 人类基因组人类基因组人类基因组人类基因组C C0 0t t曲线曲线曲线曲线二、核酸探针二、核酸探针zProbeProbe：用于测定未知核酸片段的已知序列：用于测定未知核酸片段的已知序列：用于测定未知核酸片段的已知序列：用于测定未知核酸片段的已知序列z探针为探针为探针为探针为 DNADNA 或或或或 RNARNA，可以为可以为可以为可以为单链单链单链单链或或或或双链双链双链双链z探针必需经过标记探针必需经过标记探针必需经过标记探针必需经过标记：放射性标记放射性标记放射性标记放射性标记或或或或非放射性标记非放射性标记非放射性标记非放射性标记1.探针有哪些种类？探针有哪些种类？zDNA DNA 探针探针探针探针：常规探针：常规探针：常规探针：常规探针 利用基因组利用基因组利用基因组利用基因组 DNA DNA 序列或序列或序列或序列或 cDNAcDNA 序列合成的探序列合成的探序列合成的探序列合成的探针，一般为双链，也可制备成单链针，一般为双链，也可制备成单链针，一般为双链，也可制备成单链针，一般为双链，也可制备成单链zRNA RNA 探针探针探针探针：高灵敏度：高灵敏度：高灵敏度：高灵敏度探针探针探针探针 一般是通过体外转录而来，均为单链一般是通过体外转录而来，均为单链一般是通过体外转录而来，均为单链一般是通过体外转录而来，均为单链z寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸探针探针探针探针(oligooligo-nucleotide-nucleotide)：用于用于用于用于点突变检测点突变检测点突变检测点突变检测 人工合成的短序列人工合成的短序列人工合成的短序列人工合成的短序列(20nt)(20nt)，可自由选择序列，可自由选择序列，可自由选择序列，可自由选择序列2.标记物有哪些？标记物有哪些？z标记物的要求：标记物的要求：标记物的要求：标记物的要求：y高度的高度的高度的高度的灵敏性灵敏性灵敏性灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列：足以检测到极微量的核酸序列：足以检测到极微量的核酸序列：足以检测到极微量的核酸序列y高度的高度的高度的高度的特异性特异性特异性特异性：足以在大量非特异性序列中检：足以在大量非特异性序列中检：足以在大量非特异性序列中检：足以在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列测到特异的靶序列测到特异的靶序列测到特异的靶序列z标记物的种类：标记物的种类：标记物的种类：标记物的种类：y放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素(radio isotoperadio isotope)y非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物(non-radioactive labelnon-radioactive label)放射性同位素放射性同位素z特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微级微级微级微量的核酸序列量的核酸序列量的核酸序列量的核酸序列 gmggngpgfggmggngpgfgz常用的放射性同位素常用的放射性同位素常用的放射性同位素常用的放射性同位素放射性标记的核苷酸单体放射性标记的核苷酸单体zdNTPdNTP or NTP or NTPz5 or 3 P5 or 3 P3232 labellinglabelling非放射性标记物非放射性标记物z特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素y地高辛：地高辛：地高辛：地高辛：通过地高辛抗体结合并检测通过地高辛抗体结合并检测通过地高辛抗体结合并检测通过地高辛抗体结合并检测y生物素：生物素：生物素：生物素：结合亲和素结合亲和素结合亲和素结合亲和素/链亲和素链亲和素链亲和素链亲和素(avidinavidin/streptavidinstreptavidin)y化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光y电子密度标记物：金等重金属电子密度标记物：金等重金属电子密度标记物：金等重金属电子密度标记物：金等重金属3.如何检测杂交信号？如何检测杂交信号？z同位素标记物：同位素标记物：同位素标记物：同位素标记物：y盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器y放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影(autoradiographyautoradiography)如何检测杂交信号？如何检测杂交信号？z非放射性标记物：非放射性标记物：非放射性标记物：非放射性标记物：y酶联免疫技术酶联免疫技术酶联免疫技术酶联免疫技术(enzyme linked enzyme linked immunoimmuno-assay-assay)y化学发光化学发光化学发光化学发光(chemiluminescencechemiluminescence)三、如何对核酸探针进行标记？三、如何对核酸探针进行标记？1.缺口平移缺口平移znick translation:nick translation:z适用于适用于适用于适用于标记标记标记标记双链双链双链双链DNADNAz控制控制控制控制 DNaseDNase I I 的的的的用量，可以控制用量，可以控制用量，可以控制用量，可以控制探针的长度探针的长度探针的长度探针的长度2.非放探针的酶促标记非放探针的酶促标记z生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可以参入探针以参入探针以参入探针以参入探针3.非放探针的化学标记非放探针的化学标记z利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合四、如何进行四、如何进行杂交杂交？z样品样品样品样品(DNA or RNA)(DNA or RNA)吸附于支持物吸附于支持物吸附于支持物吸附于支持物y尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等z与标记的探针杂交与标记的探针杂交与标记的探针杂交与标记的探针杂交y封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行z缓冲液清洗缓冲液清洗缓冲液清洗缓冲液清洗y控制温度与变性剂浓度控制温度与变性剂浓度控制温度与变性剂浓度控制温度与变性剂浓度z显色显色显色显色y放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影/酶联显色酶联显色酶联显色酶联显色五、五、杂交杂交有哪些不同的方式？有哪些不同的方式？z斑点杂交斑点杂交斑点杂交斑点杂交：dot hybridizationdot hybridizationzSouthern Southern 印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交：Southern blotSouthern blotzNorthern Northern 印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交：Northern blotNorthern blotyWestern blottingWestern blotting：不是杂交：不是杂交：不是杂交：不是杂交z原位杂交：原位杂交：原位杂交：原位杂交：in situ in situ hybridizationhybridizationz反反反反 Northern Northern 印迹杂交：印迹杂交：印迹杂交：印迹杂交：reverse Northern blotreverse Northern blotz基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片/DNA/DNA微阵列微阵列微阵列微阵列：GenechipGenechip/DNA/DNA microarraymicroarraydot hybridizationz将将将将核酸核酸核酸核酸样品直接点在杂交膜上样品直接点在杂交膜上样品直接点在杂交膜上样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交与探针进行杂交与探针进行杂交与探针进行杂交z特点：简便但特异性不高特点：简便但特异性不高特点：简便但特异性不高特点：简便但特异性不高可探测核酸含量，但无法得知分子大小可探测核酸含量，但无法得知分子大小可探测核酸含量，但无法得知分子大小可探测核酸含量，但无法得知分子大小Southern blotzEdwin Southern Edwin Southern 创立的方法创立的方法创立的方法创立的方法z电泳技术与杂交结合，可显示靶电泳技术与杂交结合，可显示靶电泳技术与杂交结合，可显示靶电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA DNA 序列的长度序列的长度序列的长度序列的长度z可进行毛吸管转移、真空转移与电转移可进行毛吸管转移、真空转移与电转移可进行毛吸管转移、真空转移与电转移可进行毛吸管转移、真空转移与电转移电泳电泳转膜转膜杂交杂交Northern blotz类似于类似于类似于类似于 Southern Southern 印迹杂交的方法印迹杂交的方法印迹杂交的方法印迹杂交的方法，用于，用于，用于，用于 RNA RNA 检测检测检测检测in situ hybridizationz原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交：特定：特定：特定：特定 mRNA mRNA 的组织的组织的组织的组织细胞细胞细胞细胞分布分布分布分布FISHzFluorescence in situ hybridizationFluorescence in situ hybridization (FISH)(FISH)：特定基：特定基：特定基：特定基因的染色体定位因的染色体定位因的染色体定位因的染色体定位反反 Northern 杂交与杂交与 DNA 芯片芯片z反反反反 Northern Northern 杂交杂交杂交杂交：将探针：将探针：将探针：将探针 DNA DNA 片段固定在杂交膜片段固定在杂交膜片段固定在杂交膜片段固定在杂交膜上，利用标记物标记的上，利用标记物标记的上，利用标记物标记的上，利用标记物标记的 RNA RNA 进行杂交进行杂交进行杂交进行杂交第二节：聚合酶链式反应第二节：聚合酶链式反应zPCRPCR，polymerase chain reactionpolymerase chain reactiony在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定 DNA DNA 片段的高效手段片段的高效手段片段的高效手段片段的高效手段z7070 年年年年代代代代有人提出有人提出有人提出有人提出 PCR PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的的设想，因缺乏寡核苷酸的的设想，因缺乏寡核苷酸的的设想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和适合的酶而无法进行合成手段和适合的酶而无法进行合成手段和适合的酶而无法进行合成手段和适合的酶而无法进行z1984 1984 年年年年 KaryKary Mullis Mullis 发明发明发明发明 PCRPCR，并因此获得并因此获得并因此获得并因此获得 1993 1993 年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖z全自动的热循环仪和多种全自动的热循环仪和多种全自动的热循环仪和多种全自动的热循环仪和多种 PCR PCR 衍生技术使其衍生技术使其衍生技术使其衍生技术使其成成成成为重为重为重为重要的科学研究手段要的科学研究手段要的科学研究手段要的科学研究手段一、一、PCR 的基本原理的基本原理z在体外，以特定在体外，以特定在体外，以特定在体外，以特定引物引物引物引物引引引引导，通过导，通过导，通过导，通过 DNADNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域z变性变性变性变性(denaturedenature)z退火退火退火退火(annealanneal)z延伸延伸延伸延伸(extensionextension)DNADNA的体内复制的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNADNA解解旋解链旋解链ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA解解旋解链旋解链引物引物合成合成DNADNA的体内复制的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解解旋解链旋解链引物引物合成合成新链新链延伸延伸DNA的体内复制的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35变性复性加热退火DNA加热解链模板DNA9455引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第1轮结束94第2轮开始72TaqTaqTaqTaq55第2轮结束重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性新链延伸DNA的体外扩增的体外扩增热循环DNA解链PCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200 mol/L引物 各0.1-0.5 mol/L模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶 2.5 UMg2+1.5mmol/LDNA的体外扩增的体外扩增PCR 技术的特点技术的特点z高度的灵敏性高度的灵敏性高度的灵敏性高度的灵敏性：理论上经：理论上经：理论上经：理论上经 20 20 循环可将目的基因片段循环可将目的基因片段循环可将目的基因片段循环可将目的基因片段扩增扩增扩增扩增 2 220201000000 1000000 倍倍倍倍z高度的特异性高度的特异性高度的特异性高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可：利用引物与模板的特异性配对，可：利用引物与模板的特异性配对，可：利用引物与模板的特异性配对，可保证扩增的特异性保证扩增的特异性保证扩增的特异性保证扩增的特异性y一对一对一对一对 20 20 碱基长引物的多样性为碱基长引物的多样性为碱基长引物的多样性为碱基长引物的多样性为4 4404010102424z应用的广泛性应用的广泛性应用的广泛性应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不：目前已经成为分子生物学研究必不：目前已经成为分子生物学研究必不：目前已经成为分子生物学研究必不可少的手段可少的手段可少的手段可少的手段z操作的简便性操作的简便性操作的简便性操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程：不需要复杂的设备和繁琐的流程：不需要复杂的设备和繁琐的流程：不需要复杂的设备和繁琐的流程二、做二、做 PCR 要有什么条件？要有什么条件？z酶酶酶酶：TaqTaq DNA DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶z模板模板模板模板 DNADNA：可以为基因组可以为基因组可以为基因组可以为基因组 DNA DNA 或或或或 cDNAcDNAz引物引物引物引物：人工合成的寡核苷酸片段：人工合成的寡核苷酸片段：人工合成的寡核苷酸片段：人工合成的寡核苷酸片段zdNTPdNTP：聚合反应的核苷酸单体聚合反应的核苷酸单体聚合反应的核苷酸单体聚合反应的核苷酸单体z缓冲液：包含特定的缓冲液：包含特定的缓冲液：包含特定的缓冲液：包含特定的 pHpH、离子强度和离子强度和离子强度和离子强度和 MgMg2+2+z反应程序：变性、退火、延伸组成的循环反应程序：变性、退火、延伸组成的循环反应程序：变性、退火、延伸组成的循环反应程序：变性、退火、延伸组成的循环z仪器：仪器：仪器：仪器：DNA DNA 热循环仪，或称热循环仪，或称热循环仪，或称热循环仪，或称 PCR PCR 仪仪仪仪DNA聚合酶催化的聚合反应dNTP1.什么是什么是耐热耐热 DNA 聚合酶聚合酶z早期早期早期早期 PCR PCR 曾曾曾曾使用使用使用使用 DNA DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I Iy在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶y延伸反应温度为延伸反应温度为延伸反应温度为延伸反应温度为 37 37，非特异性太多，非特异性太多，非特异性太多，非特异性太多z目前常用目前常用目前常用目前常用 TaqTaq DNA DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶y纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌 (ThermusThermus aquaticusaquaticus)y可耐受可耐受可耐受可耐受 95 95 高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为 72 72 左右左右左右左右Taq DNA polymerasez在在在在 7075 7075 范围活性最佳，每秒可延伸范围活性最佳，每秒可延伸范围活性最佳，每秒可延伸范围活性最佳，每秒可延伸 150 150ntntz95 95 时的半衰期为时的半衰期为时的半衰期为时的半衰期为 40 40 minminy按变性时间按变性时间按变性时间按变性时间 1 1 min min 计，能满足计，能满足计，能满足计，能满足 30 30 循环的反应循环的反应循环的反应循环的反应zTaqTaq 酶具有酶具有酶具有酶具有 5 5 3 3 聚合活性和聚合活性和聚合活性和聚合活性和 5 5 3 3 外切活性外切活性外切活性外切活性z不具备校读活性不具备校读活性不具备校读活性不具备校读活性，错误率为，错误率为，错误率为，错误率为 210 2104 4 左右左右左右左右y错误合成的错误合成的错误合成的错误合成的 DNADNA片段可以作为模板，循环数越片段可以作为模板，循环数越片段可以作为模板，循环数越片段可以作为模板，循环数越多，最终扩增产物错误率越高多，最终扩增产物错误率越高多，最终扩增产物错误率越高多，最终扩增产物错误率越高y只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆有有保真性保真性的的耐热耐热 DNA 聚合酶聚合酶吗？吗？zPfuPfu DNA polymerase DNA polymerase：y常用的高保真耐热常用的高保真耐热常用的高保真耐热常用的高保真耐热 DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶y有有有有5 5 3 3 外切外切外切外切活性活性活性活性y错误率约错误率约错误率约错误率约 110 1106 6y适应于基因克隆适应于基因克隆适应于基因克隆适应于基因克隆2.如何设计如何设计寡聚核苷酸引物寡聚核苷酸引物？z引物引物引物引物(primerprimer)是是是是 PCR PCR 反应必备的前反应必备的前反应必备的前反应必备的前提提提提，对，对，对，对 PCR PCR 产物产物产物产物类型、长度和反应的特异性具有决定作用类型、长度和反应的特异性具有决定作用类型、长度和反应的特异性具有决定作用类型、长度和反应的特异性具有决定作用zPCR PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段长度长度长度长度引物设计原则引物设计原则z引物长度一般为引物长度一般为引物长度一般为引物长度一般为 1530 1530 核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸y引物太短引物太短引物太短引物太短影响杂交体的稳定和特异性影响杂交体的稳定和特异性影响杂交体的稳定和特异性影响杂交体的稳定和特异性y引物太长引物太长引物太长引物太长随机匹配序列增随机匹配序列增随机匹配序列增随机匹配序列增多多多多，特异性，特异性，特异性，特异性反而下降反而下降反而下降反而下降zGC GC 含量一般为含量一般为含量一般为含量一般为 4 40 0 6 60 0y应充分考虑应充分考虑应充分考虑应充分考虑退火温度退火温度退火温度退火温度(annealing temperatureannealing temperature)xGC GC 含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异xGC GC 含量高，非特异性含量高，非特异性含量高，非特异性含量高，非特异性结合结合结合结合也会增加也会增加也会增加也会增加y引物解链温度粗略引物解链温度粗略引物解链温度粗略引物解链温度粗略计算公式：计算公式：计算公式：计算公式：引物的解链温度引物的解链温度引物的解链温度引物的解链温度TmTm4(4(GGC)C)2(A2(AT)T)引物设计原则引物设计原则z引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发卡结构卡结构卡结构卡结构 z两条引物间两条引物间两条引物间两条引物间、同一引物的分子间、同一引物的分子间、同一引物的分子间、同一引物的分子间不应存在互补序列不应存在互补序列不应存在互补序列不应存在互补序列yy出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率引物设计原则引物设计原则z避免引物与非特异序列间的同源性避免引物与非特异序列间的同源性避免引物与非特异序列间的同源性避免引物与非特异序列间的同源性z引物的引物的引物的引物的 3 3，末端必末端必末端必末端必须须须须与模板完全互补与模板完全互补与模板完全互补与模板完全互补，5 5，末端允许添末端允许添末端允许添末端允许添加非配对序列加非配对序列加非配对序列加非配对序列y5 5，末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列，如：，如：，如：，如：酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点533.如何选择如何选择 dNTP 和缓冲液和缓冲液?zdNTPdNTP 是聚合反应的底物是聚合反应的底物是聚合反应的底物是聚合反应的底物y常规使用浓度：常规使用浓度：常规使用浓度：常规使用浓度：0.2 0.2 mMmM each eachy探针标记时，可使用同位素或非放标记的探针标记时，可使用同位素或非放标记的探针标记时，可使用同位素或非放标记的探针标记时，可使用同位素或非放标记的 dNTPdNTPz缓冲液：特定的缓冲液：特定的缓冲液：特定的缓冲液：特定的 pH pH 和离子强度和离子强度和离子强度和离子强度yMgMg2 2浓度一般为浓度一般为浓度一般为浓度一般为 1.5 1.5 mMmMzPCR mixPCR mix：预制的便捷反应体系：预制的便捷反应体系：预制的便捷反应体系：预制的便捷反应体系4.用什么做用什么做模板模板 DNA？zPCR PCR 的的的的模板模板模板模板(templatetemplate)可以是基因组可以是基因组可以是基因组可以是基因组 DNADNA 或或或或 cDNAcDNAy逆转录逆转录逆转录逆转录-PCR(PCR(reversereverse transcription PCR transcription PCR)：RT-RT-PCRPCRz在利用在利用在利用在利用 DNA DNA 为模板进行扩增时纯化为模板进行扩增时纯化为模板进行扩增时纯化为模板进行扩增时纯化比较简单比较简单比较简单比较简单yy血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单处理后均可直接进行处理后均可直接进行处理后均可直接进行处理后均可直接进行 PCR PCR 扩增扩增扩增扩增zRNA RNA 样品一般要经过样品一般要经过样品一般要经过样品一般要经过严格严格严格严格纯化，并逆转录纯化，并逆转录纯化，并逆转录纯化，并逆转录yy未经纯化的未经纯化的未经纯化的未经纯化的 RNA RNA 不稳定，无法进行逆转录不稳定，无法进行逆转录不稳定，无法进行逆转录不稳定，无法进行逆转录yy反应体系中如存在反应体系中如存在反应体系中如存在反应体系中如存在 DNADNA，将对将对将对将对 RNA RNA 扩增产生干扰扩增产生干扰扩增产生干扰扩增产生干扰 6.如何设计如何设计反应程序反应程序？zPCR PCR 的循环数：的循环数：的循环数：的循环数：y理论上理论上理论上理论上 20 25 20 25 即可满足即可满足即可满足即可满足扩增需要，但实际循环数扩增需要，但实际循环数扩增需要，但实际循环数扩增需要，但实际循环数一般为一般为一般为一般为 25 35 25 35y过多循环后到达平台期，过多循环后到达平台期，过多循环后到达平台期，过多循环后到达平台期，继续延长循环数无效继续延长循环数无效继续延长循环数无效继续延长循环数无效y模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平台期出现晚，台期出现晚，台期出现晚，台期出现晚，应根据模板浓度调节循环数应根据模板浓度调节循环数应根据模板浓度调节循环数应根据模板浓度调节循环数反应程序反应程序的关键是退火温度的关键是退火温度z退火温度：退火温度：退火温度：退火温度：y提高退火温度有助于提高提高退火温度有助于提高提高退火温度有助于提高提高退火温度有助于提高反应的特异性反应的特异性反应的特异性反应的特异性y退火温度过高将导致引物退火温度过高将导致引物退火温度过高将导致引物退火温度过高将导致引物与模板无法配对，影响扩增与模板无法配对，影响扩增与模板无法配对，影响扩增与模板无法配对，影响扩增效率效率效率效率y反应的退火温度主要取决反应的退火温度主要取决反应的退火温度主要取决反应的退火温度主要取决于引物序列于引物序列于引物序列于引物序列 三、我们能用三、我们能用 PCR 做什么？做什么？z自自自自 PCR PCR 技术创立以来，经近技术创立以来，经近技术创立以来，经近技术创立以来，经近 20 20 年的发展，在基本年的发展，在基本年的发展，在基本年的发展，在基本 PCR PCR 技术基础上产生了多种技术基础上产生了多种技术基础上产生了多种技术基础上产生了多种 PCR PCR 的衍生技术，应的衍生技术，应的衍生技术，应的衍生技术，应用于各种不同的目的用于各种不同的目的用于各种不同的目的用于各种不同的目的y基因克隆或亚克隆基因克隆或亚克隆基因克隆或亚克隆基因克隆或亚克隆基因工程基因工程基因工程基因工程y特定基因表达量的分析特定基因表达量的分析特定基因表达量的分析特定基因表达量的分析y基因突变的检测基因突变的检测基因突变的检测基因突变的检测基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断y病原体特征性序列的鉴定病原体特征性序列的鉴定病原体特征性序列的鉴定病原体特征性序列的鉴定基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断y定点诱变定点诱变定点诱变定点诱变第第第第 4 4 节节节节yDNA DNA 序列测定序列测定序列测定序列测定第第第第 3 3 节节节节最常用的最常用的 PCR 是是 RT-PCRzRT-PCRRT-PCR：reverse transcription PCRreverse transcription PCRz以以以以 mRNA mRNA 为模板为模板为模板为模板z先进行逆转录，再进行先进行逆转录，再进行先进行逆转录，再进行先进行逆转录，再进行 PCRPCRz为什么要以为什么要以为什么要以为什么要以 mRNA mRNA 为模板？为模板？为模板？为模板？zmRNA mRNA 无内含子，克隆的基因可在原核表达无内含子，克隆的基因可在原核表达无内含子，克隆的基因可在原核表达无内含子，克隆的基因可在原核表达zmRNAmRNA 的量代表了基因的表达水平的量代表了基因的表达水平的量代表了