大肠菌群检测操作规范培训.ppt

大肠菌群检测操作规范培训大肠菌群检测操作规范培训质量管理部质量管理部目录目录一、细菌介绍一、细菌介绍二、大肠杆菌生物学特性二、大肠杆菌生物学特性三、大肠杆菌检测仪器、设备三、大肠杆菌检测仪器、设备四、检测培养基及试剂四、检测培养基及试剂五、检测前培养基准备五、检测前培养基准备六、接种培养六、接种培养七、七、MPN单位介绍单位介绍八、检测注意事项八、检测注意事项一、细菌介绍一、细菌介绍细菌是单细胞原核微生物，个体微小细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约（细胞直径约0.5m,0.5-5m），结构，结构简单，以二等分裂方式繁殖。在自然简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。界中，细菌分布最广、数量最多。1、细菌的形态 细菌个体微小、形态各异细菌个体微小、形态各异球菌球菌杆菌杆菌弧菌与弯曲菌弧菌与弯曲菌螺旋菌及螺旋体螺旋菌及螺旋体不规则形不规则形弧菌弧菌2、细菌的结构 细菌的基本结构包括：细胞壁、细菌的基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞膜、间体、细胞浆、核糖体、细胞质。间体、细胞浆、核糖体、细胞质。细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞。菌毛和芽胞。3、细菌的繁殖 细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，殖。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞壁，这样便产生两个子细胞。4、细菌的菌落 单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团菌落。形态构造的子细胞集团菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落图细菌的菌落图二、大肠杆菌生物学特性大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏阴性、两端钝圆的杆菌，无芽孢，以周生阴性、两端钝圆的杆菌，无芽孢，以周生鞭毛运动或不运动。鞭毛运动或不运动。最适生长温度为最适生长温度为37，在，在42-44条件下仍条件下仍能生长，生长温度范围为能生长，生长温度范围为15-46。1、大肠杆菌平板菌落图片、大肠杆菌平板菌落图片2、大肠杆菌革兰氏染色图片、大肠杆菌革兰氏染色图片3、大肠杆菌微菌落图片、大肠杆菌微菌落图片4、大肠杆菌透射电镜图片、大肠杆菌透射电镜图片5、大肠杆菌扫描电镜图片、大肠杆菌扫描电镜图片6、大肠杆菌分裂图片、大肠杆菌分裂图片三、检测仪器、设备三、检测仪器、设备 冰箱：冰箱：04 恒温培养箱：恒温培养箱：361 恒温水浴锅：恒温水浴锅：461 微生物显微镜微生物显微镜架盘药物天平：架盘药物天平：0g500g，精确至，精确至0.5g 三角瓶：三角瓶：500ml 灭菌吸管：灭菌吸管：1ml、10ml 灭菌平皿：直径灭菌平皿：直径90mm 试管：试管：18180mm四、检测培养基及试剂四、检测培养基及试剂乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂乳糖发酵管乳糖发酵管革兰氏染色液革兰氏染色液生理盐水生理盐水乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。35g乳糖胆盐于乳糖胆盐于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，试管中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。倍。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。30g乳乳糖于糖于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板检测。检测。37.5g于于1升蒸馏水中，摇匀，加热升蒸馏水中，摇匀，加热煮沸，煮沸，12115分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。五、检测前培养基准备五、检测前培养基准备 检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培养基小导管内是否有气体。养基小导管内是否有气体。按产品品种将培养基分别放在试管架内，按产品品种将培养基分别放在试管架内，同时将同时将9ml 0.85%灭菌盐水管也放入相应的灭菌盐水管也放入相应的试管架内。试管架内。六、接种培养（一）酸牛奶系列产品（一）酸牛奶系列产品酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基9支管，分别接种样品量为支管，分别接种样品量为1ml(原浓度原浓度)3支，支，0.1ml(10-1浓度浓度)3支，支，0.01ml(10-2浓度浓度)3支。支。1、1ml接种培养接种培养在无菌条件下，用在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1ml样样品试液于含有品试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成振荡摇匀制成1:10的稀释液；同时分别吸取的稀释液；同时分别吸取1ml样品试液于样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。并轻微振荡摇匀，放入原位置。THANK YOUSUCCESS2024/5/7 周二27可编辑2、0.1ml接种培养接种培养另换另换1根根1ml灭菌移液管吸取灭菌移液管吸取1:10的稀释液的稀释液1ml于含有于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成荡摇匀制成1:100的稀释液；同时分别吸取的稀释液；同时分别吸取1ml 1:10稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。3、0.01ml接种培养接种培养另换另换1根根1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 1:100稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。并轻微振荡摇匀，放入原位置。4、接种过程操作录像接种过程操作录像检测检测单料大肠检测单料大肠检测.MPG讨论讨论录像中存在的问题：录像中存在的问题：1、整个微生物检测前应先消毒手。、整个微生物检测前应先消毒手。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。3、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻轻抖出。轻抖出。4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。5、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。5、接种后培养、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h，观察乳糖胆，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。盐发酵管的变化情况。6、结果查询并记录、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。报告大肠菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。若有产酸产气，则要做证实试验。（二）活性乳酸菌饮料系列产品二）活性乳酸菌饮料系列产品活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆盐发酵培养基盐发酵培养基3支管，单料乳糖胆盐发酵培支管，单料乳糖胆盐发酵培养基养基6支，分别接种样品量为支，分别接种样品量为10ml 3支，支，1ml 3支，支，0.1ml 3支。支。1、10ml接种培养接种培养在无菌条件下，用在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1ml样品试样品试液于含有液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成匀制成1:10的稀释液；同时用的稀释液；同时用10ml灭菌吸管分灭菌吸管分别吸取别吸取10ml样品试液于样品试液于3支双料乳糖胆盐发酵支双料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。2、1ml接种培养接种培养另用另用1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 样品试液样品试液于于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。摇匀，放入原位置。3、0.1ml接种培养接种培养另换另换1根根1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 1:10稀稀释液于释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。振荡摇匀，放入原位置。4、接种过程操作录像、接种过程操作录像检测检测双料大肠检测双料大肠检测.MPG讨论讨论录像中存在的细节问题：录像中存在的细节问题：1、整个微生物检测前应先消毒手。、整个微生物检测前应先消毒手。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。3、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻轻抖出。轻抖出。4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。5、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。5、接种后培养、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h，观察乳糖胆，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。盐发酵管的变化情况。6、结果查询并记录、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。报告大肠菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。若有产酸产气，则要做证实试验。（三）证实试验（三）证实试验1、伊红美蓝琼脂平板分离、伊红美蓝琼脂平板分离将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分别接种于伊红美兰琼脂平板别接种于伊红美兰琼脂平板(划线分离划线分离)，置，置于于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h。接种和分离工具接种和分离工具1接种针接种针 2.接种环接种环 3.接种钩接种钩 4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.接种圈接种圈 7.接种锄接种锄 8.小解剖刀小解剖刀平板分离画线法平板分离画线法1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格法四格法将伊红美蓝琼脂平板从培养箱取出后将伊红美蓝琼脂平板从培养箱取出后,观察观察菌落形态，并做革兰氏染色和乳糖复发酵菌落形态，并做革兰氏染色和乳糖复发酵试验。试验。革兰氏染色：见革兰氏染色：见革兰氏染色及镜检操作革兰氏染色及镜检操作规范规范。（四）乳糖发酵试验（四）乳糖发酵试验挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培养基，置于发酵培养基，置于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h，观察产气情况。，观察产气情况。凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。根据证实为大肠菌群的阳性管数，查根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，查找每检索表，查找每100ml样品内的大肠菌群的样品内的大肠菌群的MPN值。值。七、七、MPN单位介绍单位介绍MPN=Most Probable Number，最大可能，最大可能数数，是一种利用统计学检测微生物的方法。，是一种利用统计学检测微生物的方法。食品大肠菌群是以每克或食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌中大肠菌群的最近似值，是用群的最近似值，是用MPN来表示。来表示。采用采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养基进行培养，然释度接种三管相应的培养基进行培养，然后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测样品相应指标的样品相应指标的MPN值。值。八、注意事项八、注意事项 乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管，若有气泡上冒，也算产气。管，若有气泡上冒，也算产气。在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属光泽，则为典型菌落，光泽，则为典型菌落，98%以上为大肠菌群。以上为大肠菌群。革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。型菌落；无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。如果只有红色或粉色菌落，应挑取如果只有红色或粉色菌落，应挑取3个进行革兰氏染色，个进行革兰氏染色，并接种乳糖发酵培养基。并接种乳糖发酵培养基。如果有红色和粉色菌落，则各挑取如果有红色和粉色菌落，则各挑取3个做革兰氏染色，个做革兰氏染色，各挑取各挑取3个接种乳糖发酵培养基混合接种。个接种乳糖发酵培养基混合接种。大肠杆菌接种培养流程大肠杆菌接种培养流程1、用酒精棉球擦拭操作台，点酒精灯，消、用酒精棉球擦拭操作台，点酒精灯，消毒手，擦拭样品表面并记录，消毒手，消毒手，擦拭样品表面并记录，消毒手，消毒剪刀，剪开样品袋。毒剪刀，剪开样品袋。2、接种培养时，先接生理水管，再接乳糖、接种培养时，先接生理水管，再接乳糖胆盐发酵管。双料的先接生理盐水管，接胆盐发酵管。双料的先接生理盐水管，接1ml原样，再接原样，再接10ml 的原样。的原样。3、操作完后，先熄灭酒精灯再消毒操作台、操作完后，先熄灭酒精灯再消毒操作台和擦拭酒精灯外周。和擦拭酒精灯外周。THANK YOUSUCCESS2024/5/7 周二54可编辑