细菌的常用生化试验.ppt

细菌的常用生化试验细菌的常用生化试验细菌室2323种细菌鉴定常用生化试验种细菌鉴定常用生化试验1.碳水化合物的代谢试验（1）糖（醇、苷）类发酵试验（2）氧化一发酵试验（OF试验）（3）-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）（4）七叶苷水解试验（5）甲基红试验（6）V-P试验2.蛋白质和氨基酸的代谢试验（1）明胶液化试验（2）吲哚（靛基质）试验（3）硫化氢试验）尿素分解试验（5）苯丙氨酸脱氨酶试验（6）氨基酸脱羧酶试验3.碳源和氮源利用试验（1）枸橼酸盐利用试验（2）丙二酸盐利用试验4.各种酶类试验（1）氧化酶试验（2）过氧化氢酶试验（触酶试验）（3）硝酸盐还原试验（4）脂酶试验（5）卵磷脂酶试验（6）DNA酶试验（7）凝固酶试验（8）CAMP试验一、碳水化合物的代谢试验一、碳水化合物的代谢试验原理由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验有：糖类发酵试验；葡萄糖代谢类型鉴别试验；七叶苷水解试验；淀粉水解试验；甲基红试验；V-P试验；-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）。1.糖（醇、苷）类发酵试验糖（醇、苷）类发酵试验原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。2.氧化氧化-发酵试验（发酵试验（0/F试验）试验）原理：不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lcm。将培养基于35培养48h或更长。结果：应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别，前者是发酵型，后者是氧化型。发酵型（产酸）氧化型产碱型3.-半乳糖苷酶试验（半乳糖苷酶试验（ONPG试验）试验）原理细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是半乳糖苷透性酶，它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为-半乳糖苷酶，亦称乳糖酶，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在2448h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min3h观察结果。结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在2030min内显色。应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。4.七叶苷水解试验七叶苷水解试验原理方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。5.甲基红试验甲基红试验原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养24d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。6.V-P试验试验原理方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于35培养48h后加入甲液（6%-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振摇。结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于354h后仍如故者即为阴性。应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验二、蛋白质和氨基酸的代谢试验原理：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。具体试验有：明胶液化试验；吲哚试验（靛基质试验）；硫化氢试验；尿素酶试验；苯丙氨酸脱氨酶试验；氨基酸脱羧酶试验。1.明胶液化试验明胶液化试验原理方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22培养7d，逐日观察结果。结果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。2.吲哚（靛基质）试验吲哚（靛基质）试验原理方法：将待检菌接种于蛋白胨水培养基中，于35培养2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验硫化氢试验原理方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35培养2448h观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。4.尿素分解试验尿素分解试验原理方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35培养l824h观察结果。结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性5.苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验原理方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35培养l824h，滴加10%三氯化铁试剂34滴，自斜面上方流下。结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。6.氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验原理方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35培养l4d，每日观察结果。结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。三、碳源和氮源利用试验三、碳源和氮源利用试验1.枸橼酸盐利用试验原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35培养l4d，每日观察结果。结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。2.丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变碱。方法：将被检菌接种于丙二酸盐培养基培养基，35培养2448h后观察结果。结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。四、酶类试验四、酶类试验1.氧化酶试验原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。方法：常用方法有三种；菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。2.过氧化氢酶试验（触酶试验）过氧化氢酶试验（触酶试验）原理方法：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。注意事项3%H2O2溶液要新鲜配制。不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应。取对数生长期的细菌。3.硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验原理：在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养l4d。将甲（对氨基苯磺酸0.8g+5molL醋酸lOOml）、乙液（-奈胺0.5g+5mol/L醋酸lOOml）等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观察结果。结果：出现红色为阳性。应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气。4.脂酶试验脂酶试验原理：有的细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚蓝释放出来，呈现深蓝色。方法：将被检菌接种于脂酶培养基（含维多利亚蓝）中，于37培养24h结果：培养基变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色。应用：主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆菌产生脂酶，其他类杆菌则阴性；芽胞梭菌属中产芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶，而其他梭菌阴性。5.卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验原理：有的细菌产生卵磷脂酶（-毒素），在钙离子存在时，此酶可迅速分解卵磷脂，生成浑浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。方法：将被检菌划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，于35培养36h。结果：若3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为阳性，6h后混浊环可扩展至56mm。应用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌产生此酶，其他梭菌为阴性。6.DNA酶试验酶试验原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于酸，所以当在菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现透明环。方法：将被检菌点种于0.2%DNA琼脂平板上，于35培养l824h，然后用lmol/L盐酸覆盖平板，观察结果。结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。应用：在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，故本试验可用于细菌的鉴别。7.凝固酶试验凝固酶试验原理方法：1）玻片法：取兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。2）试管法：取试管2支，各加0.5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入血浆中并混匀，于37水浴34h。结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。8.CAMP试验试验原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的B-溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B群链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现矢形（半月形）的溶血区。方法：先以产B-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上，再将被检菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，相距0.5lcm，于37培养1824h，观察结果。每次试验都应设阴性和阳性对照。结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定