电化学发光免疫分析法.ppt

电化学发光免疫分析法电化学发光免疫分析法Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI)主讲人 崔天根 电化学发光免疫分析法 Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI)u免疫分析法u发光和化学发光u化学发光免疫分析法u电化学发光u电化学发光免疫分析法免疫分析法u它是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。u抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性反应，它既可以发生在体内，也可以发生在体外。u免疫标记技术是将一些既容易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质或含量。免疫学检测的发展阶段免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程:中国免疫学检测的历史演进放射免疫检测：兴于20世纪70年代，现在已经基本淘汰，可能有些小医院还在使用。酶联免疫检测：兴于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法。以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术，始于20世纪90年代，现广泛应用于县级以上各医疗机构，产品已经步入成熟期。按示踪物及标记种类分放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术化学发光免疫技术金免疫技术 匀相免疫测定 非匀相免疫测定按示踪物及标记种类分按测定物反应体系的物理状态分免疫分析检测的技术分类发 光 的 分 类u光照发光：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。u生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子的形式放出。u化学发光：在常温下由化学反应产生的光的发射，化学发光是一个多步骤的过程。在自然界有各种各样的发光现象在自然界有各种各样的发光现象发光萤火虫萤火虫发光深海鱼发光化 学 发 光Chemiluminescence（CL）化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。化学发光反应包括两个关键的步骤：化学激发和发光化学发光分析-根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，成为化学发光分析。化学发光免疫分析-是集灵敏的化学发光技术和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。化学发光免疫分析的特点：灵敏度高、特异性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。化学发光免疫分析Chemiluminescence immunoassay(CLIA)化学发光免疫技术的类型化学发光免疫技术的类型u 按发光剂不同分为1.发光酶免疫测定（Chemiluminescence enzyme immunpassay CLEIA）2.化学发光免疫测定技术（Chemiluminescence immunoassay CLIA）3.电化学发光免疫测定技术（Electrocheminluminescence immunoassay ECLI）u 按分离方法不同分1.微离子化学发光免疫测定2.磁颗粒化学发光免疫测定 化学发光剂化学发光剂机制 某些化合物可以利用化学反应产生能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态，当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。化学发光剂或发光底物 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂。化学发光剂应符合以下几个条件化学发光剂应符合以下几个条件能参与化学反应；与抗原或抗体偶联后成稳定的结合物试剂；偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫 活性。鲁米诺1,酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的发光底物有鲁米诺、对一羟基苯乙酸AP的发光底物有AMPPD、4MUP（荧光底物）特点：可做标记物，也可以做过氧化物酶的底物酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物1.鲁米诺HPA在H2O2存在下被PR氧化成氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计计量。对一羟基苯乙酸（HPA）原理 属于酶免疫测定的一种，只是最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。技术类型 根据酶促反应所用底物不同可分为：1 荧光酶免疫测定技术 2 化学发光酶免疫测定技术 根据免疫学反应模式分 1 双抗体夹心法和双抗原夹心法 2 固相抗原竞争法一，发光酶免疫测定（CLEIA）化学发光酶免疫测定技术反应原理图1.抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶颗粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间后，再加入AP标记抗体，温育，形成固相包被抗原抗体酶标记复合物。2.分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗原-胶乳微粒抗体复合物被保留在纤维膜上。3.酶促发光反应 加入4-MUP，酶标抗体上的AP将4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激发光照射下发出448nm的荧光，经光记录仪放大处理计算出待测物质的含量。发光酶免疫测定技术的技术要点分离技术1.磁颗粒分离法 原理为血清样品与标准品中的抗原或抗体与磁颗粒上的一定量的抗体或抗原反应，产生的抗原抗体磁性颗粒复合物，在磁场作用下沉降，使结合部分与游离部分分离。2.微粒子捕获法 采用无磁性的微粒子作为抗原抗体的包被载体，然后用纤维膜柱子进行酶标记物的结合和游离状态的分离。3.包被珠分离法 用聚苯乙烯等材料制成用作包被抗原抗体的小珠，经抗原抗体反应后，将结合状态和游离状态的酶标记物分离。二二.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(ELIA)(ELIA)原理 用发光剂直接标记抗原或抗体，与待测样本中相应的抗体或抗原、磁性颗粒上的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光发应。技术类型 1 分离方法 常用磁颗粒分离技术 2 免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术，不同的只是相 应的标记物是吖啶脂而不是酶。直径2.8微米磁性微粒子固相亲和素生物素亲和素生物素三三,电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)电化学发光(ECL)原理 是指在电极上施加一定波形的电压或电流信号,进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象.它包含了电化学和化学发光两个过程.ECL和CL的区别在于:ECL是电启动发光反应,而CL是通过化合物混合启动发光反应,因此ECL反应便于精确控制,具有灵活性.电化学发光剂uECL分析中采用三联吡啶钌作为标记物，其活化衍生物是三联吡啶钌+N羟基琥珀酸胺脂（NHS），该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。u三联吡啶钌衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。u三联吡啶钌衍生物分子量小，空间位阻小，即便是小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，有更为广阔的开发前景。三联吡啶钌的特点电化学发光标记物-三联吡啶三联吡啶钌钌 N N羟基琥珀酰胺羟基琥珀酰胺(NHS)(NHS)酯酯光子620nm 电化学发光（电化学发光（ECLECL）检测的技术原理）检测的技术原理二价的三联吡啶钌在电场的作用下，失去一个电子氧化成三价的三联吡啶钌同时，在电场的作用下，三丙胺也失去一个电子被氧化,然后脱氢成三丙胺自由基三丙胺自由基传递一个电子给三价的三联吡啶钌使之进入激发态激发态的三联吡啶钌不稳定,以发射一个波长为620nm的光子的形式释放能量而回到基态三联吡啶钌不被消耗,即发光标记物可循环发光CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3+e-CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3CH2CH2CH3+H+CH3CH2CH2-N-HCH2CH2CH3+CH3CH2CHO氧化电极.+.H氧化Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+还原三丙胺(tripropylamine,TPA)ECL的测定模式ECL的优势注注:试剂表现不仅仅表现在灵敏度和宽线性试剂表现不仅仅表现在灵敏度和宽线性,还有特异性还有特异性,重现性重现性,线性回归线性回归,携带率携带率,准确性和临床符合性等多种表现准确性和临床符合性等多种表现灵敏度高(10-1210-18)，可达Pg/ml或Pmol水平重复性好 CV5.0%检测线性宽(7个数量级)试剂稳定，无污染，有效期长操作简单，易于自动化ECL的临床应用肝炎肝炎乙肝表面抗原乙肝表面抗体乙肝核心抗体乙肝核心抗体M乙肝e抗原乙肝e抗体甲状腺功能甲状腺功能三碘甲状腺原氨酸甲状腺素游离三碘甲状腺原氨酸游离甲状腺素超敏促甲状腺素甲状腺摄取甲状腺球蛋白抗-TPO抗-Tg肿瘤标志物肿瘤标志物甲胎蛋白癌胚抗原糖类抗原12-5糖类抗原15-3糖类抗原19-9糖类抗原72-4游离前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原Cyfra21-1烯醇化酶代谢代谢铁蛋白B12叶酸胰岛素免疫球蛋白E生殖生殖/内分泌内分泌人绒毛膜促性腺激素总B人绒毛膜促性腺激素促黄体生成素促卵泡生成素雌二醇孕酮睾酮催乳素可的松硫酸脱氢表雄酮心血管急诊心血管急诊肌酸激酶同工酶心肌钙蛋白-T心肌红蛋白Pre-BNP地高辛洋地黄