细胞因子检测.ppt

细胞因子的检测方法细胞因子的检测方法左大明左大明2细胞因子细胞因子 一一类类由由细细胞胞分分泌泌，具具有有多多种种功功能能的的高高活活性性小小分分子子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。v白细胞介素白细胞介素(interleukin,IL)v干扰素干扰素(interferon,IFN)v肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)v集落刺激因子集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)v生长因子生长因子(growth factor,GF)v趋化因子趋化因子(chemokine)3优点：优点：敏感、可靠；敏感、可靠；缺缺点点：需需长长期期饲饲养养细细胞胞、检检测测耗耗时时长长、步步骤繁杂。骤繁杂。1不不同同的的CK具具有有不不同同的的生生物物学学活活性性，选选择择CK独独特特的的生生物物学学活活性性，即即可检测。可检测。细胞增殖细胞增殖/抑制实验抑制实验细胞病变抑制实验细胞病变抑制实验细胞毒实验细胞毒实验细胞趋化实验细胞趋化实验。生物学检测法生物学检测法细胞因子的检测方法细胞因子的检测方法2利用抗体对抗原表位的利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。细胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。免疫学检测法免疫学检测法优点：优点方便、迅速方便、迅速缺缺点点：价价格格昂昂贵贵，结结果果仅仅代代表表CK的的量量而而非非活性，敏感性较低。活性，敏感性较低。3利利用用基基因因探探针针，检检测测特特定定细细胞胞因因子子基基因因表表达达，即即mRNA水平。水平。斑点杂交斑点杂交Northern印迹印迹细胞和组织原位杂交细胞和组织原位杂交RT-PCR。分子生物学检测法分子生物学检测法局局限限性性：仅仅能能检检测测基基因因表表达达情情况况，不不能能直直接接提提供供有有关关细细胞胞因因子子的的浓浓度度和和活活性性，只用于机制探讨。只用于机制探讨。4待检样品待检样品(细胞上清细胞上清)指示细胞（指示细胞（CTLL-2CTLL-2）IL2IL-2依赖细胞系依赖细胞系按不同稀按不同稀释度加入释度加入3737C C，16-2016-20小时小时加入加入3 3HTdRHTdR（1-51-5 CiCi）3737C C，4-64-6小时小时收集细胞收集细胞测定测定细胞增殖实验细胞增殖实验5细胞病变抑制实验细胞病变抑制实验待检样品（细胞上清）待检样品（细胞上清）IFN-IFN-指示细胞指示细胞（wishwish）按不同稀按不同稀释度加入释度加入3737C C，4 4小时小时3737C C，24-4824-48小小时时弃取上清，加入弃取上清，加入VSVVSV(水泡性口炎病毒水泡性口炎病毒)观察细胞病变（镜检或比色）观察细胞病变（镜检或比色）6Using CFSE to track CML progenitor proliferationSDMSDM+Glivec7Calculation of Proliferative Index(P.I.)CFSE-43210The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells.It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.8Cell Proliferation ELISA Kit,BrdU(colorimetric)9Chromium-51(51Cr)release assays10计数受趋化细胞计数受趋化细胞趋化因子趋化因子细胞细胞趋化实验示意图趋化实验示意图微孔微孔滤膜滤膜11 用用示示踪踪物物质质标标记记抗抗体体或或抗抗原原，使使其其与与相相应应的的抗抗原原或或抗抗体体反反应应，使使微微量量的的、不不可可见见的的反反应应成成为为可见的或可测定的。可见的或可测定的。免疫标记技术免疫标记技术12 高通量细胞因子检测高通量细胞因子检测vCBA(Cytometric Bead Array)是是一一种种微微珠珠多多用用途途检检测测分分析析技技术术，它它由由一一系系列列的的微微珠珠组组合合来来捕捕获获并并结结合合流流式式细细胞胞仪仪技技术术检检测测细细胞胞培培养养液液、EDTAEDTA血血浆浆、血血清清样样本本中中被被检检测测物物质质的的量量。其其采采用用夹夹心心法法分分析析策策略略，与与传传统统的的ELISAELISA分分析析技技术术相相比比，此此方方法法可可以以同同时时检检测测多多项项指指标标。用用已已知知的的标标准准品品和和对对照照标标准准曲曲线线就就可可以以得得出出被被测测样样本本的的浓浓度度。此此分分析析方方法法不不受受样样本本量量的的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。限制，而且可以得到一个样本的多个数据。LOGOCytokine LOGOLOGO16CBA原理示意图原理示意图LOGOLOGOvLab Invest 2003,83:11311146 cytokine bead arrays(CBA)19ELISPOT(酶联免疫斑点实验酶联免疫斑点实验)vELISPOTELISPOT技技术术利利用用结结合合在在固固相相载载体体上上的的抗抗细细胞胞因因子子的的特特异异性性抗抗体体，在在分分泌泌细细胞胞周周围围直直接接扑扑获获待待检检细细胞胞因因子子。实实验验中中每每个个斑斑点点（spotspot）是是激激活活的的淋淋巴巴细细胞胞分分泌泌的的细细胞胞因因子子区区域域，代代表表一一个个活活性性淋淋巴巴细细胞胞。它它可可在在单单细细胞胞水水平平检检测测淋淋巴巴细细胞胞对对特特异异性性抗抗原原的的反反应应能力。能力。v优优点点：灵灵敏敏度度高高，是是目目前前为为止止最最灵灵敏敏的的检检测测技技术术。可可检检测测到到百百万万分分之之一一阳阳性性细细胞胞率率;单单细细胞胞水水平平、活活细胞功能检测细胞功能检测;操作简便，可进行高通量筛选。操作简便，可进行高通量筛选。1.特异性单抗包被在培养板孔底部；特异性单抗包被在培养板孔底部；2.封闭能结合单抗的其他部位；封闭能结合单抗的其他部位；3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞加入细胞及刺激物培养，阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获；分泌的细胞因子被单抗捕获；4.移出细胞，洗涤；移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的二抗；加入生物素标记的二抗；6.加入酶标链霉亲和素；加入酶标链霉亲和素；7.加入显色底物，在酶的催化分解下，加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；部的膜上形成斑点；8.斑点计数（可人工计数，也可用自斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果动读板仪计数），数据处理，结果分析。分析。ELISPOT2122应应 用用v移植研究移植研究-allograft rejection-allograft rejection v疫苗开发疫苗开发-亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 vTh0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2细胞转换分析细胞转换分析 v自体免疫研究自体免疫研究-免疫调节及免疫治疗研究免疫调节及免疫治疗研究 v癌症研究癌症研究-肿瘤反应肿瘤反应T T细胞作用细胞作用 v过过敏敏机机制制探探讨讨-IL-4-IL-4诱诱导导免免疫疫球球蛋蛋白白亚亚型型转转换换，其其它它参参与过敏机制之细胞因子的研究与过敏机制之细胞因子的研究 v传传 染染 疾疾 病病 研研 究究-Lyme-Lyme disease,disease,Chlamydia Chlamydia infections,infections,Helicobacter Helicobacter pylori pylori infections,infections,HIV HIV infections,infections,multiple multiple sclerosis,sclerosis,等等 MediumPHAPeptide 1Peptide 21Peptide 47GzBHIV-peptide recall patient BIFN-HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN-and GzBKleen T.et al,AIDS 2003,18:383-LOGOELISPOT 和和 ELISA的区别的区别ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA，又突破传统，又突破传统 ELISA ELISA 法，是定量法，是定量 ELISA ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同技术的延伸和新的发展，它们最大的不同:1.ELISA 1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量溶性蛋白总量(整体水平整体水平);ELISPOT);ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过斑点或通过ELISPOTELISPOT分析系统对斑点进行计数，分析系统对斑点进行计数，1 1个斑点代表个斑点代表1 1个细胞，从个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（单细胞水平单细胞水平）；）；2.ELISPOT2.ELISPOT比比ELISAELISA更敏感。更敏感。ELISPOTELISPOT技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫苗和药品的研发与检测等。苗和药品的研发与检测等。LOGO胞内细胞因子的检测胞内细胞因子的检测LPS活化单核细胞内活化单核细胞内TNF-的测定的测定R1：淋巴细胞；：淋巴细胞；R2：单核细胞：单核细胞26TNF-的诱生和检测的诱生和检测v主主要要由由单单核核/巨巨噬噬细细胞胞及及其其他他多多种种细细胞胞产产生生，能能使杀伤肿瘤细胞使杀伤肿瘤细胞;vTHP-1THP-1(人人单单核核细细胞胞系系)在在LPSLPS(脂脂多多糖糖)刺刺激激下下可可分泌分泌TNF-TNF-;vL929L929(小小鼠鼠成成纤纤维维细细胞胞)可可被被THP-1THP-1分分泌泌的的TNF-TNF-杀伤，且细胞的死亡率与杀伤，且细胞的死亡率与TNF-TNF-活性成正比活性成正比;v四四甲甲基基偶偶氮氮唑唑盐盐(MTTMTT)在在活活细细胞胞线线粒粒体体的的琥琥珀珀酸酸脱氢酶的作用下，被还原呈脱氢酶的作用下，被还原呈蓝黑色蓝黑色的的MTT-MTT-甲瓒。甲瓒。27离心收集离心收集培养上清培养上清加入加入加入四甲基偶加入四甲基偶氮唑盐氮唑盐(MTT)37C,5%CO2,LPS,18-24h放线菌放线菌素素D处理处理37C,5%CO2,18-24h37C,5%CO2,4-6h吸出上清，加入吸出上清，加入DMSO，测，测OD570TNF-的诱生和检测的诱生和检测