分子生物学技术-分子克隆.ppt

研究生科研基本训练 常用实验基本技术生物化学与分子生物学系肖鹏 生物医学研究常用基本技术分子克隆技术（DNA重组技术）免疫印迹技术（Western blot）免疫组织化学技术（免疫组化）细胞培养技术局限性 联合应用分子克隆技术DNA体外重组技术：体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法将感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。基本过程 分、切、连、转、筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。目的基因的来源：直接分离 适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收DNA。(适合原核)人工合成序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较短的）。由mRNA逆转录合成cDNA细胞总RNA分离 mRNA分离 目的基因mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克隆从基因组文库中筛选目的基因首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出来。载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS,multiple cloning sites)，便于进行克隆分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、-互补显色反应（蓝白斑筛选）表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件生物安全性好目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。载体载体2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术 DNA体外重组技术总RNA制备Trizol法:主要用途：总RNA提取（DNA、蛋白质提取）主要成分：苯酚、异硫氰酸胍等适用组织：人类、动物、植物、微生物的组织，细菌或真菌样品量：从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。InvitrogenTRIzol产品RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒Trizol法提取总RNA步骤以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。研磨液室温放置5分钟，然后以每1 ml Trizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置3分钟。取上层水相于一新的离心管，按每1 ml Trizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000 g离心10分钟。弃去上清液，按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下 7500 g 离心5分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。Tips：样品收集后迅速放入液氮；样品在Trizol溶液中相对稳定；注意避免RNase，尤其是内源的；丰度低的mRNA：实验所需的耗材需要0.1%DEPC水处理，高压灭菌 丰度中等以上的mRNA：耗材高压灭菌即可。获得高纯度RNA，要懂得取舍；上清取适量即可（500 ul）。完全干燥的RNA溶解度极低；完全干燥的RNA呈透明状；趁RNA沉淀仍然呈白色的时加水溶解RNA样品相关实验要尽快进行，如需保存RNA，需存于-80度超低温冰箱；避免RNA酶污染由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转录过程中都要避免RNA酶污染。DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。实验用品用0.1%DEPC水处理（2 h），高压蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无RNA酶实验用品。操作过程中带手套、口罩。避免RNA酶污染逆转录反应（cDNA合成）逆转录（reverse transcription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。逆转录反应体系的基本成分逆转录反应体系的基本成分模板模板:组织或培养细胞总组织或培养细胞总RNA。逆转录酶：逆转录酶：AMV:禽类成髓细胞性白血病病毒禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒：莫洛尼鼠白血病病毒引物引物:oligo dT,random primer，GSP等。等。RNA酶抑制剂酶抑制剂底物：等浓度的四种底物：等浓度的四种dNTP 反应环境反应环境:缓冲液（缓冲液（RT buffer）可单独购买或逆转录试剂盒Tips：RNA质量要好；无降解RNA样品应加热变性处理；RNA 65oC处理5 min，随后迅速置于冰上，打开二级结构 这一步不加任何反应组分反应中RNA模板量要合适；太多？太少？PCR技术PCR（PolymeraseChainReaction）即聚）即聚合酶链式反应，是指在合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，聚合酶催化下，以母链以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板与母链模板DNA互补的子链互补的子链DNA的过程。的过程。一种选择性体外扩增DNA的方法.一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量扩增的技术。半保留复制KaryMullis1993年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对(3)延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达数百倍。PCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分模板模板:双链或单链双链或单链DNA 引物引物:与模板与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷特异互补的单链寡聚核苷 酸片段，一般酸片段，一般18-30bp,上下游引物上下游引物DNA聚合酶聚合酶:如如Taq酶酶（Thermus aquaticus）底物底物:等浓度的四种核苷酸（等浓度的四种核苷酸（dNTP）反应环境反应环境:含有含有Mg2+的的Tris-Cl缓冲液。缓冲液。含含DNA聚合酶的聚合酶的2反应混合物反应混合物模板：模板：PCR反应必须以反应必须以DNA为模板进行扩增为模板进行扩增,模板模板DNA可以是可以是单链单链分子分子,也可以是也可以是双链双链分子分子,可以是可以是线状线状分子分子,也可以是也可以是环状环状分子分子(线状分子线状分子比环状分子的扩增效果稍好比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.PCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分引物：引物：PCR反应产物的特异性由一对上下反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。游引物所决定。与模板与模板DNA特异互补的单链特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物上下游引物PCR反应体系的基本成分浓度浓度:0.1umolumol/L 6 10123 1013Primer 错配率错配率 非特异性产物非特异性产物 引物二聚体引物二聚体 引物设计原则引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。引物中G+C含量通常为40%-60%四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。在引物内,尤其在3端应不存在二级结构两引物之间尤其在3端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。引物5端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基引物的选择与设计从文献中查找利用引物设计软件获得：如Primer 在线软件Blast分析 NCBI BLAST Nucleotide blast 直接找 Taq DNA聚合酶：Taq polymerase Thermus aquaticus 53 DNA 聚合酶活性以及 53 核酸外切酶活性 无 35核酸外切酶活性 致命弱点：出错率高 LA Taq polymerase,PrimeStar DNA polymerase,Pfu DNA polymerase，Fast Pfu DNA polymerasedNTP：dATP dUTP dCTP dGTP一般反应中每种dNTP的终浓度为200250 mol/L。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。PCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分含Mg2+的反应缓冲液：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。PCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分浓度浓度:1.5 mmol/LMg2+Product 特异性特异性 Mg2+Product 特异性特异性 Vary Mg2+in steps of 0.5 mM.PCR体系的建立体系的建立25or50 lsinamicroEppendorf(0.2ml)tubePCR反应的条件反应的条件预变性：预变性：94，5min变性：变性：94,30s,模板模板DNA变性成为单链变性成为单链退火：退火：Tm-5,30s，引物与模板，引物与模板DNA结合结合延伸：延伸：72，与扩增片段长度有关，与扩增片段长度有关，1Kb,延长时间延长时间循环数：循环数：25-35，平台期之前。，平台期之前。最终延伸：最终延伸：72，10min。3-4 hoursUV visualisationThe final productTips：反应体系混匀；正负对照必须有；反应条件可以尝试梯度，且只改变一个变量；根据实验需求选择相应品牌的DNA聚合酶 Master Mix;带Loading的Mix；快速的；保真的；RT-PCR定义：将RNA的逆转录反应（Reverse Transcription）和cDNA的聚合酶链扩增（Polymerase Chain Reaction）联合应用的一种技术。目前对目的基因的mRNA表达进行定性和半定量分析的最常用方法。RT-PCR步骤提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。RNA提取提取逆转录反应：逆转录反应：经逆转录将经逆转录将RNA逆转录成逆转录成cDNAPCR：以以cDNA为模板，为模板，PCR扩增合成目的片段。扩增合成目的片段。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳RT-PCR应用用途:1.获得目的基因全长编码序列，用于基因克隆 2.检测目的基因mRNA表达水平（定性、半定量）优点：简单、敏感、便宜局限性：不能准确反应基因表达状况 RT-PCR/Q-PCR（Real-time Quantitative PCR）RT-PCR检测mRNA表达水平结果分析 保证内参照均一的情况下，比较目的条带 常用的内参有GAPDH、-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。获得目的基因全长编码序列，可用于进一步基因克隆Tips：所用PCR循环数需要调整,以减少平台效应，非特异性扩增产物的干扰。；对于克隆的片段来说：尽量选择保真性好的酶（pfu）进行反应；普通的Taq酶扩增效率会更好一些；（末端带A方便TA克隆）长片段可以分段进行扩增，最后拼接起来 （Double-joint PCR；SLIC）RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术 DNA体外重组技术质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒(Plasmid)：是一种独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，大小从1-200kb不等；是一种环状的双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。具有稳定可靠和操作简便的优点。质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒载体质粒载体（vector）是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。质粒DNA的分离、纯化和鉴定一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：分子量小、多拷贝、松驰控制型具有多种常用的限制性内切酶的单切点能插入较大的外源DNA片段具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。质粒DNA的分离、纯化和鉴定从细菌中分离质粒DNA包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增收集和裂解细胞分离和纯化质粒DNAu 常用质粒提取方法：煮沸法 碱裂解法 一般质粒提取试剂盒u三种形式(见后)：共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)超螺旋DNA开环DNA(Open circular DNA,简称 ocDNA)线状DNA(Linear DNA)质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒鉴定方法：酶切电泳PCR鉴定测序序列比对质粒DNA的分离、纯化和鉴定RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术 DNA体外重组技术质粒和PCR产物的酶切酶切酶切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。限制性内切酶：限制性内切酶：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。来源：细菌和真菌功能：以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3 端为OH。Werner Arber、Danien Nathans、Hamilton Smith 1978年 诺贝尔生理学和医学奖质粒和PCR产物的酶切限制性内切酶限制性内切酶命名：命名：根据其来源命名。如：根据其来源命名。如：根据其来源命名。如：根据其来源命名。如：属名属名属名属名菌株名菌株名菌株名菌株名EEcocoRIRI种名种名种名种名编号编号编号编号EcoRIEcoRI来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌E.coliE.coli的的的的RY13RY13菌株菌株菌株菌株,I,I指在该菌株中分离的第一个限指在该菌株中分离的第一个限指在该菌株中分离的第一个限指在该菌株中分离的第一个限制酶。制酶。制酶。制酶。酶来源的生物名称缩写酶来源的生物名称缩写属名属名-种名种名-株名株名-发现次序发现次序质粒和PCR产物的酶切分类分类：限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。特性特性 I型型 II型型 III型型限制和修限制和修饰饰活性活性限制作用所需限制作用所需辅辅助因助因子子特异性特异性识别识别位点位点切割位点切割位点序列特异的切割序列特异的切割在基因工程的在基因工程的应应用用双功能双功能酶酶ATP、Mg2+非非对对称序列称序列距距识别识别位点位点1000 bp处处随机切割随机切割不是不是用用处处不大不大核酸内切核酸内切酶酶和甲和甲基化基化酶酶分开分开Mg2+回文回文对对称称结结构构位于位于识别识别位点上位点上是是广泛使用广泛使用 双功能双功能酶酶 ATP、Mg2+非非对对称序列称序列 距距识别识别位点下游位点下游24-26bp处处 是是 用用处处不大不大质粒和PCR产物的酶切型限制性核酸内切酶的特点及作用特性型限制性核酸内切酶的特点及作用特性型酶限制修饰系统分别由型酶限制修饰系统分别由限制酶限制酶和和修饰酶修饰酶两种不同两种不同的酶组成。的酶组成。它的分子量小，仅需它的分子量小，仅需MgMg2 2做辅助因子，它们能识别双做辅助因子，它们能识别双链链DNADNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。识别顺序一般为识别顺序一般为4 46 6个碱基对，识别顺序具有个碱基对，识别顺序具有180180度的度的旋转对称性，具有回文结构。旋转对称性，具有回文结构。5-CTGCAG-35-GTTAAC-33-GACGTC-53-CAATTG-5型酶切割双链型酶切割双链DNA产生产生2种不同切口种不同切口l平末端：在识别顺序的对称轴上，对平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时同时切割形成平末端，如：切割形成平末端，如：SmaI5CCCGGG33GGGCCC55CCC3GGGGGG3CCC5质粒和PCR产物的酶切质粒和PCR产物的酶切l粘末端粘末端：5突出粘末端：突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割在识别序列的两侧末端切割DNA双链，双链，于对称轴的于对称轴的5末端切割产生末端切割产生5端突出的粘性末端，如：端突出的粘性末端，如：HindIII5AAGCTT33TTCGAA55 A3 T TCGA 55 AGCT T 3A 53突出粘末端突出粘末端:与与5突出粘末端作用相反，产生突出粘末端作用相反，产生3端突出端突出粘末端，如：粘末端，如：Pst I5CTGCAG33GACGTC55 C T G C A 33 GG 33 A C G T C 5限制性核酸内切酶的单位限制性核酸内切酶的单位在适当的条件下（在适当的条件下（T，pH，离子强度等）一小时内，离子强度等）一小时内完全酶解完全酶解1g特定特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的底物所需要的限制性核酸内切酶的量，定义为量，定义为1个活性单位。个活性单位。目前常用的酶单位的定义是：目前常用的酶单位的定义是：37，1小时内小时内50ul反反应体系完全酶解应体系完全酶解1gDNA所需的酶量。所需的酶量。在建立酶切体系时，酶的用量一般为在建立酶切体系时，酶的用量一般为15U/gDNA质粒和PCR产物的酶切质粒和PCR产物的酶切影响酶切的因素影响酶切的因素DNA限制性内切酶限制性内切酶 酶作用底物（酶作用底物（DNA纯度）纯度）反应缓冲液反应缓冲液盐离子浓度盐离子浓度（Mg2+）酶解温度与时间酶解温度与时间 DNA限制性内切酶限制性内切酶1.内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的识别位点及形成的粘性末端；2.内切酶体积不能超过反应体系内切酶体积不能超过反应体系10%，因内切酶中，因内切酶中含含50%甘油作为保护剂，甘油浓度过高会影响酶切甘油作为保护剂，甘油浓度过高会影响酶切反应；反应；3.操作应在低温下进行（冰上）。操作应在低温下进行（冰上）。质粒和PCR产物的酶切 酶作用底物酶作用底物DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、乙醚、SDS、EDTA、乙醇等，这些因素的存在均不、乙醇等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。同程度影响限制性内切酶的活力。质粒和PCR产物的酶切反应缓冲液反应缓冲液酶切缓冲液成分及作用：酶切缓冲液成分及作用：Tris-HCl，维持，维持pH在在7.48.0；Mg2+，内切酶活性所必需；，内切酶活性所必需；NaCl/KCl，增加离子浓度，利于酶活性；，增加离子浓度，利于酶活性；二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTT)，保护酶，防止二硫键的形成，保护酶，防止二硫键的形成不同的内切酶选择特定的反应缓冲液不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。质粒和PCR产物的酶切盐离子浓度盐离子浓度不同的限制性内切酶对盐离子强度（不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同）有不同的要求的要求.一般按离子强度不同分为低（一般按离子强度不同分为低（10mmol/L）、）、中（中（50mmol/L）、高盐（）、高盐（100mmol/L）三类。）三类。Mg2+是酶切反应必需的是酶切反应必需的。质粒和PCR产物的酶切酶解温度与时间酶解温度与时间温度：大多数限制酶反应温度为温度：大多数限制酶反应温度为37，也有的酶需在，也有的酶需在50或其他温度下进行反应。或其他温度下进行反应。时间：一般时间：一般1-2小时即可，进行大量小时即可，进行大量DNA酶解反应时，可酶解过夜。酶解反应时，可酶解过夜。质粒和PCR产物的酶切l星号活力星号活力(Staractivity)限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能够切割限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称为一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称为星号活力。星号活力。星号活力出现的原因：星号活力出现的原因：酶用量太大酶用量太大100U/ugDNA酶切体系中离子强度太低，酶切体系中离子强度太低，10（V/V）EcoRI反应体系反应体系pH值过高值过高8PstI一般反应体系的一般反应体系的pH为为7.0左右左右反应体系中存在有机溶剂，如乙醇，反应体系中存在有机溶剂，如乙醇，DMSO等等有与有与Mg竞争的其它二价阳离子，如竞争的其它二价阳离子，如Mn离子离子质粒和PCR产物的酶切应用：构建载体酶切片段及载体本身基因克隆时转化子鉴定线性化载体质粒和PCR产物的酶切Tip 双酶切 Vs 分步酶切 Fermentas FastDigest NEB 质粒和PCR产物的酶切不完全酶切RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术 DNA体外重组技术外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：带有相同的粘性末端：用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。带有平末端：是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。重组DNA的连接连接连接：是在一定条件下，由：是在一定条件下，由DNA连接酶（DNA ligase）酶催化两个双链酶催化两个双链DNA片段相邻的片段相邻的5端磷酸与端磷酸与3端羟基之间端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。形成磷酸二酯键的过程。重组DNA的连接DNA连接酶主要分为两种：连接酶主要分为两种：T4DNA连接酶连接酶催化催化催化催化dsDNAdsDNAdsDNAdsDNA粘末端连接及平端连接粘末端连接及平端连接粘末端连接及平端连接粘末端连接及平端连接大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶不能催化平末端连接不能催化平末端连接不能催化平末端连接不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链其底物只能是带缺口的双链其底物只能是带缺口的双链其底物只能是带缺口的双链DNADNADNADNA分子和具有同源互补粘末端的不同分子和具有同源互补粘末端的不同分子和具有同源互补粘末端的不同分子和具有同源互补粘末端的不同DNADNADNADNA分子分子分子分子重组DNA的连接lT4DNA连接酶连接酶的特性的特性T4DNA连接酶是连接酶是T4噬菌体基因噬菌体基因30编码的编码的产物。最早是从产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为取的。分子量为68KD，需要，需要ATP作为辅助因作为辅助因子子并由并由ATP提供能量。提供能量。重组DNA的连接lT4DNA连接酶缓冲液的成分及作用连接酶缓冲液的成分及作用常用的反应液为常用的反应液为pH7.6的的TrisHcl，连接最佳，连接最佳pH7.2-7.8需要需要ATP作为辅助因子并由作为辅助因子并由ATP提供能量提供能量DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用等巯基化合物可促进连接酶的连接作用高浓度的高浓度的Na+,K+等抑制酶的活性等抑制酶的活性重组DNA的连接lT4DNA连接酶的作用条件连接酶的作用条件对于粘性末端一般在对于粘性末端一般在1215之间进行反之间进行反应，比较通用的条件是应，比较通用的条件是16过夜过夜连接。连接。Tips：一般来说粘性末端连接效率比平端高；连接反应可提高温度，缩短反应时间；粘性末端链接保证方向性，平端尽量少用RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术 DNA体外重组技术转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。重组质粒的转化感受态细胞：最常用感受态细胞：最常用E.coli DH5a菌株受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。重组质粒的转化为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：细胞生长状态和密度质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 重组质粒的转化试剂的质量防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,重组质粒的转化初步筛选：抗性筛选、蓝白斑筛选 重组子鉴定：菌落PCR，酶切电泳检测，测序技术重组质粒的筛选重组子筛选重组子筛选：在不同层次上、不同水平上进行筛选，：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。体大小，酶切结果，筛选标记等。初步筛选：进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。抗性筛选：Amp+，Kan+,Neo+等-互补现象筛选：蓝白斑筛选重组质粒的筛选蓝白斑筛选重组质粒的筛选ColonyPCR（菌落（菌落PCR）菌落菌落PCR可不必提取基因组可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行为模板进行PCR扩扩增，省时少力。增，省时少力。通常利用此方法进行重组体的筛选或者通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分测序分析。析。菌落菌落PCR的实验方法的实验方法PCR混合物的制备混合物的制备（25l）2MasterMix12.5lPrimer1（sense，10M）1lPrimer2（antisense，10M）1lddH2O10.5l重组质粒的筛选常温下随机挑选转化板上的白色转化子，用灭菌常温下随机挑选转化板上的白色转化子，用灭菌的枪头挑取少量菌体，将沾有菌体的枪头置于相应的枪头挑取少量菌体，将沾有菌体的枪头置于相应的装有的装有PCR混合物的混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好管中洗涤数下（管子做好记号，将记号标于侧壁），盖紧管子。记号，将记号标于侧壁），盖紧管子。+-将混有菌体的将混有菌体的PCR混合物置于混合物置于PCR仪中，按以下仪中，按以下条件扩增。条件扩增。预变性：预变性：94 5min 5min变性：变性：9430s复性复性+延伸：延伸：601min补齐：补齐：727min35个循环个循环电泳检测是否得到目的片段电泳检测是否得到目的片段酶切电泳检测，测序技术重组质粒的筛选+-RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术 DNA体外重组技术凝胶电泳琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。注意：注意：EB为为强诱变剂并有中等毒性强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时配制和使用时都应戴手套都应戴手套,注意操作，污染区域隔离注意操作，污染区域隔离琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。凝胶电泳琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。凝胶电泳2、琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。小于0.5kb 胶浓度是1.2-1.5%,大于10kb 胶浓度为0.3-0.7%,于两者之间 胶浓度为0.8-1.0%。凝胶电泳3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。超螺旋DNA线状双链DNA开环(相同分子量)凝胶电泳4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大(即分子量大的片段越跑越快)因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。凝胶电泳5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15。6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。凝胶电泳常用电泳缓冲液：TAE含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸TBE(Tris-硼酸和EDTA)TPE(Tris-磷酸和EDTA)一般配制成浓缩母液,储于室温。凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳用途：分离、鉴定、纯化 DNA 片段的主要方法，目前主要用于重组基因的分离、鉴定、限制性酶切图谱分析、Southern、Northern 杂交分析，以及 PCR 产物的分离鉴定等。PCR产物鉴定，分离纯化基因克隆操作中重组质粒鉴定酶切产物鉴定凝胶电泳经典的分子克隆方法具体操作过程中遇见过的问题：目的基因中包含想用的酶切位点不完全酶切载体上没有合适的酶切位点加上个位点？多个目的基因需要往同一个载体上连接挨个查序列找酶切位点？更简单、快捷、高效更简单、快捷、高效的方法？的方法？SLIC：sequenceandligationindependentcloningSLIC：是一种：是一种不依赖不依赖于基因于基因序列序列和和连接反应连接反应的高效基因克隆的高效基因克隆新方法新方法.T4DNAPolymerase：在在dNTP和引物链存在的情况下，具有模板依赖的和引物链存在的情况下，具有模板依赖的5-3DNA聚合酶活性；聚合酶活性；在无在无dNTP存在的情况下，具有存在的情况下，具有3-5核酸外切酶活性核酸外切酶活性SLIC法构建重组质粒流程法构建重组质粒流程SLIC法构建重组质粒效率法构建重组质粒效率30 bp长度的互补序列重组效率最高；RecA可以提高重组效率RecA的作用随着DNA浓度加大减弱SLIC法构建多片段重组质粒法构建多片段重组质粒3片段连接5片段连接10片段连接SLIC法构建重组质粒具体操作法构建重组质粒具体操作SLIC法构建重组质粒具体操作法构建重组质粒具体操作引物设计PCR获得PTP1B序列（带有一段与载体序列）T4 DNA Polymerase处理混合实验目的：实验目的：构建N末端携带His tag的PTP1B的表达载体。实验材料：实验材料：pET-15b-EGFP(表达载体，N端携带His tag,洪梅构建，已测序)pGEX-6p-2-PTP1B(full length)（PTP1B N端携带GST