现代医学实验学-靶向血管抗肿瘤药物研究方法.ppt

靶向血管的抗肿瘤药物研究方法靶向血管的抗肿瘤药物研究方法 陈雪红陈雪红 人体机能实验室人体机能实验室靶向血管的抗肿瘤药物在临床肿瘤治疗中靶向血管的抗肿瘤药物在临床肿瘤治疗中的意义的意义 恶性肿瘤在全球范围内已成为常见病、多发病，恶性肿瘤在全球范围内已成为常见病、多发病，据世界卫生组织报告，全球据世界卫生组织报告，全球5050多亿人口中，每年新多亿人口中，每年新诊断的肿瘤患者约为诊断的肿瘤患者约为900900万人，因肿瘤而死亡者达万人，因肿瘤而死亡者达700700万人，占总病死率的近万人，占总病死率的近20%20%。传统的肿瘤治疗方法如手术、放疗和化疗虽有传统的肿瘤治疗方法如手术、放疗和化疗虽有一定的进展，但都有它们本身的局限性。一定的进展，但都有它们本身的局限性。1971 1971年，美国科学家、哈佛大学医学院教授年，美国科学家、哈佛大学医学院教授JudahJudahFolkman Folkman 首次提出首次提出肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成这一观点。随后，在这一领域肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成这一观点。随后，在这一领域的研究逐渐深入，针对肿瘤新生血管的治疗策略层出不穷。的研究逐渐深入，针对肿瘤新生血管的治疗策略层出不穷。肿瘤血管的生成肿瘤血管的生成血管前期 肿瘤聚集体生成后即进入无血管生长期肿瘤聚集体生成后即进入无血管生长期,通过弥散作用使肿瘤获得足够的营养和氧通过弥散作用使肿瘤获得足够的营养和氧,并运并运走代谢产物。当肿瘤体积增至走代谢产物。当肿瘤体积增至(1(12)mm32)mm3以上时以上时,如无新生血管长入如无新生血管长入,肿瘤组织将保持休眠状态肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。或发生退化。血管期 一旦血管长入肿瘤一旦血管长入肿瘤,血液供应变为灌注血液供应变为灌注,肿瘤将快速生长并达到难以控制的体积。多种组肿瘤将快速生长并达到难以控制的体积。多种组织的肿瘤内微血管密度织的肿瘤内微血管密度(MVD)(MVD)高于正常。新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧高于正常。新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧,还提还提供大量的生长因子和存活因子供大量的生长因子和存活因子,促进其生长。促进其生长。肿瘤血管和正常血管的区别肿瘤血管和正常血管的区别不成熟：血管管腔内皮细胞不连续、基膜异常内皮形状异常、相互之间联系松散对大分子的渗透性高以及由此引起的高的间隙压增殖快，增殖细胞比例高，血管平滑肌层不完整或缺乏血管系统杂乱无序，具有复杂的分支系统，血管直径异常，分支点之间距离较长，对于血流的阻力较大血流速度低，甚至是间断的毛细血管中包含高水平的血红蛋白，缺氧的微环境Bloodflowrate(ml/g/min)靶向血管的抗肿瘤药物分类靶向血管的抗肿瘤药物分类靶向新生肿瘤血管的药物靶向新生肿瘤血管的药物 肿瘤新生血管生成抑制剂肿瘤新生血管生成抑制剂（tumorangiogenesisinhibitors，TAIs）抗血管新生，主要通过改变促进和抑制血管生成因子的平衡关系来抑制肿瘤抗血管新生，主要通过改变促进和抑制血管生成因子的平衡关系来抑制肿瘤新生血管的生长，如阻断促血管生成因子与其受体结合，使用抗血管生成因子等。新生血管的生长，如阻断促血管生成因子与其受体结合，使用抗血管生成因子等。代表药物：代表药物：TNP470、血管抑制素（、血管抑制素（Angiostatin）、内皮抑制素、内皮抑制素（Endostatin）、凝血栓蛋白（）、凝血栓蛋白（Thrombospondin1）靶向既成肿瘤血管的药物靶向既成肿瘤血管的药物 血管破坏剂血管破坏剂（vascular disrupting agents,VDAs）血管靶向，利用肿瘤血管内皮细胞生长活跃，特异地高表达一些分子的特性，血管靶向，利用肿瘤血管内皮细胞生长活跃，特异地高表达一些分子的特性，构建相关的耦联毒素或同位素的抗体（生物导弹），或者制成这些肿瘤血管内皮构建相关的耦联毒素或同位素的抗体（生物导弹），或者制成这些肿瘤血管内皮细胞相关分子的疫苗，靶向性地杀伤肿瘤血管内皮细胞。细胞相关分子的疫苗，靶向性地杀伤肿瘤血管内皮细胞。代表药物代表药物：CA 4 P、ZD6126，FAA VEGF抑制剂：抗抑制剂：抗VEGF单克隆抗体单克隆抗体 贝伐单抗贝伐单抗(Bevacizumab,Avastin)2004年年2月月26日获得日获得FDA批准上市用于一线治疗晚期大肠癌批准上市用于一线治疗晚期大肠癌,在缓解率生存期、疾病进展时间等方面有明显疗效在缓解率生存期、疾病进展时间等方面有明显疗效。在晚期非。在晚期非小细胞肺癌的临床应用中也取得满意疗效。小细胞肺癌的临床应用中也取得满意疗效。靶向血管治疗的特点靶向血管治疗的特点肿瘤细胞不易产生耐药性；肿瘤血管内皮细胞的有限损伤就可造成大量肿瘤细胞的生长抑制，不会对骨髓和造血器官产生毒性；抗血管生成治疗可应用到很多中恶性肿瘤，具有广谱性 20012001年，中国医学科学院肿瘤医院联年，中国医学科学院肿瘤医院联合全国合全国2424家临床医院，对恩度进行了近家临床医院，对恩度进行了近500500例的大规模临床实验。例的大规模临床实验。20052005年年9 9月月1212日，恩日，恩度获得国家新药证书，成为拥有自主知识度获得国家新药证书，成为拥有自主知识产权的国家一类新药。产权的国家一类新药。血管破坏剂分类血管破坏剂分类CA4类药物黄酮乙酸类药物 CA4P FAADMXAADisruption of endothelial cells by treatment with CA-4-P or DMXAAtubulin(green)actin(red)研究方法研究方法体外筛选体外筛选 血管内皮细胞模型；大鼠动脉环血管内皮细胞模型；大鼠动脉环;血管生成因子血管生成因子模型；高通量筛选模型模型；高通量筛选模型体内筛选体内筛选 鸡胚绒毛尿囊膜模型、鼠耳模型、基质胶塞模鸡胚绒毛尿囊膜模型、鼠耳模型、基质胶塞模型、啮齿动物的角膜微囊、斑马鱼模型型、啮齿动物的角膜微囊、斑马鱼模型肿瘤模型肿瘤模型 小鼠小鼠Lewis 肺癌、黑素瘤肺癌、黑素瘤B16在体观察血管发育的模式生物 模式生物：通常指人们研究生命现象过程中长期、反复作为模式生物：通常指人们研究生命现象过程中长期、反复作为研究材料的物种，如，果蝇、线虫、斑马鱼、鸡胚、拟南芥等。研究材料的物种，如，果蝇、线虫、斑马鱼、鸡胚、拟南芥等。人们在对这些物种的形态、解剖、生理、生化、细胞及遗传进行人们在对这些物种的形态、解剖、生理、生化、细胞及遗传进行全面分析和归纳的基础上，把它们作为典范，将对其研究得出的全面分析和归纳的基础上，把它们作为典范，将对其研究得出的规律，推演到相关的生物物种中，从而加快了对其他各种生物的规律，推演到相关的生物物种中，从而加快了对其他各种生物的研究。研究。模式生物的发展 早在20世纪最初的20年中，甚至更早到20世纪的“上世纪”，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上，发育的现象难题可以得到部分解答（细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察；由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性）所以利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共同规律是可能的。尤其是当在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普遍原理也就得以建立。因为对这些生物的研究具有帮助我们理解生命世界一般规律的意义，所以它们被称为“模式生物”。模式生物的特点生理特征能够代表生物界的某一大类群生理特征能够代表生物界的某一大类群容易获得并易于在实验室中饲养繁殖容易获得并易于在实验室中饲养繁殖容易进行实验操作容易进行实验操作在体观察血管发育的模式生物斑马鱼、鸡胚斑马鱼作为模式生物的特点：斑马鱼作为模式生物的特点：斑马鱼基因与人类基因的相似度达到斑马鱼基因与人类基因的相似度达到8787，这意味着在其身，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视此它受到生物学家的重视 ；斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响其体内器官的影响 ;雌性斑马鱼可产卵雌性斑马鱼可产卵200200枚，胚胎在枚，胚胎在2424小时内就可发育成形，这小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因究病理演化过程并找到病因 鸡胚绒毛尿囊膜模型鸡胚的生物学构造鸡胚的生物学构造尿囊尿囊卵黄囊卵黄囊鸡胚模型的意义生理情况下新生血管形成主要发生在胚胎发育和女性月经周期内膜修复过程：在某些病理情况下。如损伤修复、炎症等也常伴发血管生成。特别是肿瘤生长和转移与血管生成密切相关。早在1912年，鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型首次成功用于肿瘤研究。鸡胚对抑制血管生成的药物较敏感是一种较理想的研究抗血管形成药物的筛选模型是研究血管形成和抗血管形成的最佳体内模型之一。操作过程获取种蛋，于37，55相对空气湿度下孵育，每天翻动3次；孵育至第七天，无菌条件下加药：确定气室及胚头位置75%酒精清洗卵壳，无菌眼科镊、剪在气室处开窗，直径为2.0cm左右，小心移去蛋壳及其内侧的壳膜，观察绒毛膜尿囊血管生成情况设置对照组和实验组：对照组加生理盐水，实验组按照预先设定的药物浓度分别加药，药物加在无菌滤纸薄片上，置薄片于血管较细、密度较小部位小心把对照组和实验组放回温箱，37，55相对空气湿度，但不再翻动孵育至第810天，连续观察结果并拍照记录。对照组高浓度药物实验组对照组低浓度药物实验组中浓度药物实验组高浓度药物实验组27 解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘)1mm范围内为一级血管，5mm范围内为二级血管凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45者均计数，而穿行，绕行的血管则不计算在内一、二级血管分别观察计数，然后对一二级血管数分别进行统计学分析和拍照记录。注意事项药物加入时间选择：药物加入时间选择：鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成大约经历早期、中期和晚期3个阶段。早期胚胎的第57天，毛细血管网以出芽的方式形成新生血管；中期胚胎发育的第812天，套叠生长是主要的生长方式；而晚期胚胎的第l3l4天，血管结构已经基本成熟，此时的血管形成主要以毛细血管网的膨胀方式进行。因此，选择胚胎410天进行抗血管形成试验，此时血管形成以出芽和套叠的方式进行，处于血管生长高峰阶段，便于结果的观察。药物载体的选择：药物载体的选择：在CAM法中，固态待测物可直接加入，液态物质需要适宜载体，使药物在局部缓释起效及定位常用的药物戴体有(1)明胶海绵，(2)中速定性滤纸，(3)快速定性滤纸，(4)混合纤维素滤膜，(5)双蒸水配制浓度为0.5的M-450甲基纤维素溶液。高温高压灭菌，150l甲基纤维素溶液分6次加入直径为5mm的圆形模具中，60烤箱烘干成盘状，80烤箱中烘烤60min消毒，备用前四种载体制成直径5mm的圆片，湿热灭菌，4冰箱保存备用。鸡胚模型的应用CAMCAM模型用在肿瘤研究、子宫内膜异位症发病研究模型用在肿瘤研究、子宫内膜异位症发病研究目前，抑制肿瘤血管形成已被公认为一种崭新的抗癌战略，以肿瘤血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的活跃研究领域。抗血管生成治疗的研究现已推广到新生儿血管瘤病、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病性视网膜病变等疾病的治疗；而促血管生成对心血管疾病、胃肠道消化性溃疡等疾病的治疗也有一定的意义。