宏基因组二代测序技术诊断骨髓涂片阴性婴幼儿黑热病3例报告.pdf

859 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 11 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.11 Nov.2023宏基因组二代测序技术诊断骨髓涂片阴性婴幼儿黑热病 3 例报告谢 垒 王 瑶 马 威 范晓蕾 孙 娟 陈晓昕 王怀立郑州大学第一附属医院儿童重症医学病区（河南郑州 450052）摘要：目的 对3例骨髓涂片阴性黑热病患儿的病原学宏基因组二代测序技术（mNGS）检测结果进行分析，探讨mNGS在临床的应用价值。方法 回顾性分析2021年4月至2022年2月PICU收集的3例骨髓涂片阴性患儿黑热病的临床资料。结果 3例患儿中女2例，男1例，年龄均3岁。均有发热，骨髓涂片均阴性，外周血mNGS检测均提示利什曼原虫感染，且未见其他病原感染，经葡萄糖酸锑治疗后均治愈。结论 骨髓涂片阴性的婴幼儿黑热病早期诊断困难。对于临床感染性疾病，尤其是常规检测无法确定病原的疑难危重的感染性疾病，mNGS能提供快速准确的病原学诊断支持，助力精准诊治。关键词：黑热病；骨髓涂片；病原；宏基因组二代测序技术；婴幼儿Diagnosis of three cases of bone marrow smear-negative infantile kala-azar by metagenomics next-generation sequencing XIE Lei,WANG Yao,MA Wei,FAN Xiaolei,SUN Juan,CHEN Xiaoxin,WANG Huaili(Pediatric Intensive Care Unit,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,Henan,China)Abstract:Objective To analyze the pathogen of 3 kala-azar infants with negative bone marrow smear by metagenomics next-generation sequencing(mNGS),and to explore the clinical application value of mNGS.Methods Clinical data of 3 pediatric cases of infant kala-azar with negative bone marrow smear collected in PICU from April 2021 to February 2022 were restrospectively analyzed.Results Two of the three infants were girls and one was a boy,all under the age of three.All had fever,negative bone marrow smears,peripheral blood mNGS tests suggestive of Leishmania protozoa infection,and no other pathogenic infections were observed;all were cured after antimony gluconate treatment.Conclusions Early diagnosis of infant kala-azar with negative bone marrow smear is difficult.mNGS can provide rapid and accurate pathogenetic diagnostic support and aid in precise diagnosis and treatment for clinical infectious diseases,particularly complicated and critical infectious diseases whose pathogens cannot be determined by routine testing.Key words:kala-azar;bone marrow smear;pathogen;metagenomics next-generation sequencing;infantdoi:10.12372/jcp.2023.22e0681基金项目：河南省高等学校重点科研项目（No.22A320051）通信作者：王怀立 电子信箱：黑热病又称内脏利什曼病，是杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫引起的慢性地方性传染病1。临床特征有持续性不规则发热、肝脾肿大、全血细胞减少、高丙种球蛋白血症和体重下降等2。由于黑热病临床表现无明显特异性，极易与血液系统疾病相混淆，造成误诊或漏诊。近年来随着基因组技术的发展，宏基因组二代测序技术（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）在指导感染性疾病的诊断和治疗中突显出重要作用3。本文对郑州大学第一附属医院儿童重症监护室收治的经mNGS确诊的3例骨髓涂片阴性黑热病患儿的临床资料进行回顾性分析，探讨mNGS在婴儿黑热病诊断中的应用价值。1 临床资料例1，女，1岁，居住于河南安阳林州市，因发热5天、发现骨髓象异常1天于2021年4月18日收入院。入院前5天患儿发热，最高体温达40，当地医院查血白细胞计数（WBC）4.67109/L，血红蛋白（HB）94 g/L，血小板（PLT）131109/L，C反应蛋 860 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 11 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.11 Nov.2023白（CRP）41.63 mg/L，予头孢类抗生素（具体不详）治疗4 d，仍反复高热。复查血WBC 4.57109/L，HB 81g/L，PLT 46109/L，CRP 177.57 mg/L，降钙素原（PCT）1.05 ng/mL，骨髓涂片见原始+早幼粒细胞占11%。入院体检：轻度贫血貌，全身可见散在出血点，双侧淋巴结肿大，较大者约9 mm 6 mm，边界清，肝脾肋下未触及。初步诊断为急性白血病待排。辅助检查：血WBC 3.23109/L，HB 78 g/L，PLT 41109/L；CRP 116 mg/L，PCT 1.87 ng/mL；谷氨酸氨基转移酶90 U/L，纤维蛋白原1.32 g/L，铁蛋白3 803.3 ng/mL，三酰甘油2.27 mmol/L；血培养阴性，EB病毒和巨细胞病毒DNA检测、血培养、骨髓涂片及培养均阴性。超声检查示双侧颈部淋巴结肿大，肝胆脾胰未见明显异常。予头孢曲松80 mg/kg，qd4 d，美罗培南17 mg/kg，q6h1 d，丙种球蛋白2 g/kg及对症支持治疗5 d，患儿仍反复发热。追问病史，当地近期无类似患者。例2，男，1岁10月龄，居住于河南省安阳林州市，因发热12天、抽搐9天、血象异常6天于2021年12月21日收入院。入院前12天患儿发热，体温39，伴咳嗽、流涕，入院前9天体温升至40，抽搐1次，为全身强直大发作，持续2分钟缓解；入院前6天发热时再次抽搐1次，表现同前。当地医院查血WBC 5.94109/L，HB 100 g/L，PLT 109109/L，CRP 72.14 mg/L，血沉 74 mm/h；外周血涂片示粒系减低；胸片示支气管肺炎。予阿糖腺苷、头孢噻肟钠抗感染治疗，效果欠佳。入院体检：颈部多个淋巴结肿大，较大约1 cm0.5 cm，质韧，活动度可，无压痛；肝脏肋下5 cm，质软，脾肋下7 cm，质韧。初诊为血液系统疾病待排。辅助检查：血常规WBC 3.80109/L，HB 85.8 g/L，PLT 110109/L；CRP 59.9 mg/L，PCT 0.373 ng/mL，血沉 58 mm/h，纤维蛋白原 3.24 g/L，三酰甘油1.22 mmol/L；血培养、骨髓涂片及培养阴性。超声检查示双侧颈部淋巴结肿大，肝脾大。予拉氧头孢40 mg/kg，q12h，喷昔洛韦5 mg/kg，q12h抗感染治疗2 d，患儿仍反复发热。追问病史称当地近期有确诊黑热病患者。例3，女，2岁11月龄，居住于山西省运城市，因间断发热40天、血象异常10天、加重3天于2021年12月31日收入院。入院前40天患儿发热，体温40，干咳，当地治疗后第5天体温正常。入院前25天再次发热，体温40，当地治疗至第4天体温正常。入院前10天再次发热，体温39。查血常规WBC 3.69109/L，HB 91 g/L，PLT 112109/L，CRP 66.10 mg/L，肺炎支原体IgM阳性。当地医院予阿奇霉素、美罗培南、喜炎平、人免疫球蛋白（7.5g）、地塞米松（3 mg2 d）、甲基泼尼松龙（40 mg1 d，20 mg1 d）等治疗1周，效果欠佳。入院体检：浅表淋巴结无肿大，咽部充血，心肺无异常，腹膨隆、软，肝肋下未及，脾肋缘下6 cm，质韧。初诊为噬血细胞综合征待排，流行性感冒。辅助检查：血常规WBC 1.42109/L，HB 76 g/L，PLT 59109/L，NE 0.44109/L；CRP 37.8 mg/L，PCT 16.3 ng/mL，血沉 77 mm/h，纤维蛋白原 3.93 g/L，铁蛋白 2 885.5 ng/mL；乙型流感及呼吸道合胞病毒阳性；骨髓涂片示骨髓增生活跃，可见吞噬细胞，吞噬红细胞及血小板；血培养及骨髓培养阴性；腹部超声示脾大。予帕拉米韦10 mg/kg，qd5 d，头孢哌酮钠舒巴坦钠80 mg/kg，q8h6 d，丙种球蛋白7.5 g2 d，地塞米松2.5 g2 d，患儿仍反复高热。追问病史当地无类似患者。为明确病因，经家属及本院医学科研和临床伦理委员会（批号：2022-KY-0950-002）同意后，3例患儿均行外周血病原学mNGS检测。结果显示，例1检测到利什曼原虫属，序列数2 380，婴儿利什曼原虫种，序列数97；例2检测到利什曼原虫属，序列数21 529，婴儿利什曼原虫种，序列数7 752，杜氏利什曼原虫种，序列数9 040；例3检测到婴儿利什曼原虫，序列数2 962，杜氏利什曼原虫，序列数343。3例均未检出其他病原体。鉴于3例外周血mNGS均检测到利什曼原虫，3 例均确诊为婴儿黑热病。后续对 3 例患儿进行rK39抗体检测，结果显示，例1和例3阳性，例2阴性。3例患儿确诊后均停用原抗感染治疗，给予葡萄糖酸锑钠半支，qd肌注。例1在用药后3天体温降至正常，例2在用药后2天体温降至正常，例3在用药后4天体温降至正常。例1用药疗程为10天，第7天查骨髓涂片未见异常细胞及寄生虫，血NGS阴性，861 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 11 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.11 Nov.2023rK39抗体弱阳性；例2用药疗程为14天，第7天外周血mNGS检出婴儿利什曼原虫，序列数241，杜氏利什曼原虫，序列数84，院外继续用药7天，再次复查外周血mNGS阴性；例3用药疗程为12天，复查外周血mNGS阴性，rK39抗体阴性。3例随访至今，均体温正常，血象正常，颈部淋巴结无肿大，肝脏肋下未触及，例1和例2脾脏回缩至肋下未触及，例3脾脏肋下约1 cm。2 讨论黑热病是一种易被忽视的人兽共患传染病，传播媒介为白蛉。利什曼原虫可通过血液进入白蛉体内，从无鞭毛体繁殖成鞭毛体。7天后白蛉叮咬人体时，鞭毛体可进入人体，破坏中性粒细胞，导致机体单核-巨噬细胞大量增生，引起疾病发生4。黑热病在我国主要分布于西北部，新疆维吾尔自治区、甘肃省、四川省3个地区发病率最高，陕西省、山西省等为流行地区4，近几年河南省也有散在病例报 道5-6。本组例1和例2患儿来自河南省林州市，其中例2居住地有确诊患者，例3来自山西省，两地均有散发患者。因此，对可能来自于流行地区的发热、肝脾淋巴结肿大、抗感染治疗效果差的患儿需高度警惕此病。文献报道黑热病好发年龄以3岁婴幼儿居多，考虑可能与其免疫功能发育不完善相关，本组病例发病年龄与之相符7。临床表现以发热、肝脾肿大、外周血细胞减少多见，也可有乏力、纳差、精神萎靡等症状，缺乏特异性，极易误诊。魏荣荣等8在对山西省阳泉市17例黑热病的报道中发现，有52.94%（9/17）患者误诊为感染或血液系统疾病。本组3例患儿均有发热、全血细胞减少，例2和例3有肝脾肿大，例1和例2早期初诊为血液系统疾病，例3初诊为噬血细胞综合征。黑热病患儿骨髓涂片中可见大量吞噬红细胞、白细胞、血小板的吞噬型组织细胞，其吞噬细胞有单纯吞噬利杜体、吞噬利杜体和血细胞及单纯吞噬血细胞三种情况，尤其是第三种情况，是黑热病容易误诊为噬血细胞综合征的主要原因之一。本组3例患儿在入院第一时间行骨穿涂片检查，均未发现吞噬利杜体现象，未见幼稚细胞和异常细胞，结合其他实验室指标，排除血液系统疾病及噬血细胞综合征。3例患儿从发病到确诊时间为740 d，在确诊前也辗转多家医院就诊，抗感染等治疗无效。因此，对于长期不规则发热、全血细胞减少、肝脾肿大、贫血及抗感染治疗无效的患者，应警惕黑热病。目前黑热病的诊断主要依靠病原学和血清学检查。脾脏、骨髓和淋巴结穿刺液镜检是确诊的金标准 4。脾脏穿刺液镜检诊断的灵敏度和特异度均 90%，诊断价值最高，其次是骨髓（灵敏度 53%86%）和淋巴结穿刺液镜检（灵敏度53%65%）4。骨髓穿刺检查临床应用最为广泛，但也会出现假阴性的情况，原因可能是一方面由于实验技术人员对该病认识不足，未能识别出病原体；另一方面骨髓液采集位于黑热病间歇期，尽管发热期和间歇期均有利杜小体存在，但间歇期原虫数量较少且不典型，因此未能检出9。本组3例患儿骨髓穿刺结果均阴性，这也为前期的诊疗增加了难度。rk39免疫层析试纸条法具有较高的特异度和灵敏 度10。rk39即为利什曼原虫类 kinesin 基因中编码39个氨基酸的基因片段重组抗原，ELISA或免疫层析法都是重要且可靠的检测方法4。本组患儿中2例rk39阳性，提示灵敏性高于病原学检查，与文献报道一致11。但在检测治疗后疾病是否复发以及区别现症者与无症状感染者4方面存在缺陷。mNGS 不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观地检测样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），对于感染性疾病的病原体研究具有极高的应用价值12。近年来，mNGS已广泛应用于血液感染、呼吸道感染、骨关节感染、脑炎等方面，样本类型多样，如脑脊液、呼吸道分泌物、粪便、尿液、血液和组织等13。同时，mNGS在确定罕见病因中也表现出极大的优势，如致病性钩端螺旋 体14、日本脑炎病毒15、沙眼衣原体16等。本组3例患儿mNGS均提示婴儿利什曼原虫感染，确诊为婴儿黑热病，为临床医师提供了快速准确的病原学诊断依据，使患儿得到精准治疗。对于黑热病的治疗，锑剂为首选用药。但由于锑剂产生的耐药较为常见，目前国际上推荐两性霉 862 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 11 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.11 Nov.2023素B作为黑热病治疗的一线用药4。本组患儿均给予锑剂治疗，未出现耐药及不良反应，疗效显著。在判断患儿治疗终点时，应注意达到病原学治愈。因为患者在临床治愈的情况下，往往不能同时达到病原学治愈，容易引起黑热病复发。本组患儿在治疗过程中，分别在第7天予mNGS复查，根据mNGS结果，指导后续治疗。3例患儿均在mNGS阴性后停药治疗，目前随访预后良好，无复发。提示mNGS不仅在疾病诊断中具有指导价值，对指导治疗也有较强的意义。综上所述，婴儿黑热病极易误诊或漏诊，尤其对于骨髓涂片阴性的患儿。mNGS作为一种快速、精准的病原学诊断方法，为疑难危重的感染性疾病提供了有效的诊断支持，有助于提供精准治疗。参考文献：1 van Griensven J,Diro E.Visceral leishmaniasis:recent advances in diagnostics and treatment regimens J.Infect Dis Clin North Am,2019,33(1):79-99.2 Burza S,Croft SL,Boelaert M.Leishmaniasis J.Lancet,2018,392(10151):951-970.3 韩思雨,刘建华.宏基因组二代测序在疑难感染性疾病中的临床应用价值 J.中国当代儿科杂志,2022,24(2):210-215.4 袁宏,唐红,张跃新.中国利什曼原虫感染诊断和治疗专家共识 J.中华传染病杂志,2017,35(9):513-518.5 杨书丽,宋录军,马改青,等.河南省安阳市4例黑热病病例调查 J.中华地方病学杂志,2018,37(12):1027.6 李云霞,程睿,周瑞敏,等.河南省洛阳市1例新发本地内脏利什曼病病例的流行病学调查 J.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2021,39(3):410-413.7 何芳.儿童黑热病46例临床分析 J.临床儿科杂志,2017,35(3):191-194.8 魏荣荣,李艳,王永胜,等.山西省阳泉市17例黑热病患者临床分析 J.中华地方病学杂志,2021,40(1):59-62.9 金丽,高利红,舒敏,等.23例儿童黑热病临床分析 J.中华妇幼临床医学杂志(电子版),2018,14(1):73-76.10 张富南,肖宁,陈漪澜.rk39免疫层析试纸条检测黑热病效果评价 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