发光法测定菌体ATP含量应用.ppt

发光法测定菌体ATP含量1.实验目的 2.实验原理 3.试剂 4.实验材料与仪器 5.操作步骤及结果一.实验目的 1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.学会用荧火虫素-荧火虫素酶生物发光法定量测定ATP含量的方法;3.理解ATP生物发光原理及应用研究。二.实验原理 生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮的意思。目前，生物发光应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光，荧光素酶存在于荧火虫、水母一上些细菌中，它是生物内产生的一种生物反应蛋白质。1.ATP生物发光工作原理 荧光素酶-ATP检测法，其化学反应的结果是把化学能转化为光能。细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。其化学反应如下：ATP+D-L-Luciferin+O2 Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light 当细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失，基于这一原理，检测细胞内的ATP含量，即可反应细胞的存活状况，ATP浓度与活细胞数密切相关。检测时先将ATP与提取剂充分混合，使细胞壁和细胞膜裂解，释放ATP，再加入荧光素-荧光素酶，ATP在荧光素和荧光素酶的作用下，使其释放磷酸基团同理发出荧光，用生物荧光仪检测相对荧光强度（relative light units,RLU）,由此测出ATP含量，进而反映活细胞数。2.ATP生物发光特点优点：灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在，同时可以把ATP数量化，用荧光强度（RLU）把光定量，广泛应用于食品工业，医药，生物学等领域。缺点：荧光强度和菌落形成单位（CFU）之间没有直接关系，也无法对细菌的种属进行鉴定。3.应用研究检测环境是否被有害的微生物污染，食品卫生的检测和生产环境实时监测（HACCP）等。用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜的细菌学的测定。新药筛选及疗效评价：广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中。细胞免疫活性检测应用：ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性。三.试剂 1.荧光素-荧光酶试剂 将解冻后的12mlReocnstiuttoin Bueffr与荧光素酶-荧光素粉剂混合，轻轻摇晃（不能振荡）使其溶解。第一次使用前在室温下放置1h，以后只需20min左右。不用时要放置在-20C下保存。取0.5ml的标准ATP试剂（10-7mol/l）到5ml的容量瓶中，加入缓冲液定容，得到10-8mol/l的标准ATP试剂。用移液管取5ml的上述标准ATP试剂到50ml的容量瓶中，加入缓冲溶液定容，得到10-9mol/l的标准ATP试剂。重复以上过程，得到10-10mol/l和10-11mol/l的标准ATP试剂。2.标准ATP试剂 3.缓冲液 以Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量的Tris碱，使定容后的浓度为0.05mol/l，定容前需要先调节PH值。将PH计插入TrisI溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值为7.8，然后定容，在4C下保存。4.ATP提取液 采用三氯醋酸（TCA）作为ATP提取剂，浓度为0.03g/ml，在4C下保存。对于不同的微生物，采用不同的浓度进行提取，细菌和真核细胞的提取浓度一般为0.005-0.025g/ml，酵母真菌类则适当高一些。提取结束后，要用缓冲液将TCA的浓度稀释到一定的浓度，再进行测量，以减少TCA对反应的影响。四.实验材料与仪器TD-20/20荧光光度计抽滤器及真空泵（过滤微生物进，采用0.22微米的滤膜）PH计。五.操作步骤 1.ATP的提取 在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为ATP生物发光法测定生物量和重要步骤之一。TCA法和加热煮沸法加热煮沸法是两种常用的ATP提取方法。TCA法TCA法是目前最常用的ATP提取方法。TCA对活细胞有两种作用：一是破裂细胞，释放ATP，二是ATP水解酶失活。提取普通微生物中的ATP时，TCA浓度为0.015g/m此浓度下，TCA对ATP与荧光素酶的生物发光反应较强的抑制作用，必须在反应前对提取液进行中和，稀释。使TCA浓度小于或等于0.001g/ml，此时TCA对反应的影响基本可以忽略。一般采用PH7.8左右的Tris-Aectate缓冲液进行稀释。具体操作 取样品（如河水等，如果是固体样品需用水悬浮后取上清或匀浆）2ml置于试管中 加入2mlTCA溶液，震荡提取得3min 取1ml提取液置于50ml容量瓶中，用PH7.8的Tris-Aectate缓冲液定容稀释后的提取液置于4C下保存待测。此时TCA的浓度为0.0003g/ml，不会对反应产生 影响 加热煮沸法加热煮沸法是前期研究中采用较多的ATP提取方法。该方法先将样品中的微生物过滤出来，再 将其置于缓冲液中加热煮沸提取ATP。抽滤装置包括真空泵、滤瓶、缓冲瓶 滤膜采用0.22m孔径的醋酸纤维滤膜 高温加热的作用主要是破碎细胞同时使细胞内ATP水解酶失活 具体操作 迅速将滤膜转移到沸水浴的缓冲液中，提取5min 将装有8ml缓冲液的试管置于沸水浴中量取一定体积的样品进行抽滤 将提取液转移到10ml容量瓶，定容，试管中残留的提取液用少量Tris-Aectate缓冲液冲洗两次倒入容量瓶中 混合均匀后置于4C下保存待测 迅速放入冰水浴中冷却 2.ATP的检测 1)先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品的相对发光值.2)测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的ATP含量,ATP含量可以转化为微生物的浓度.测量荧光所用的仪器是TD-20/20荧光光度计，一般将仪器的设置延迟时间设为60s标准曲线制作在测定管中加入50 l一定浓度的标准溶液和50 l缓冲液，测定管置于样品室中，加入100l荧光素-荧光酶反应剂后迅速盖上样品室的盖子，开始检测。标准液浓度分别为10-7mol/l、10-8mol/l、10-9mol/l、10-10mol/l、10-11mol/l 空白值用去ATP水代替不同浓度的标准液进行测定，重复3次取平均值。以ATP浓度的对数值为横坐标，荧光反应值RLUS的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。由标准曲线可见，在一定的范围内，ATP浓度与荧光反应发光值之间有较好的线性关系，样品中ATP浓度与相对发光值对应。样品测定及结果用50 l样品提取液代代替标准ATP试剂，具体操作与制作标准曲线一样。最后ATP浓度与微生物浓度之间的转化，是基于每个微生物包含5 x10-16gATP。注意:荧光素酶的活性衰减很快，在室温下荧光素酶试剂只能保存8h，如果测定过程8h则应将荧光素酶反应剂健壮在多支小管中，于4C避光保存。每次使用时都要提前将酶试剂取出，并室温下放置一段时间，使其恢复到室瘟。如果样品测定要持续较长的时间，可分装酶制剂于-20C冷冻保存，保存过程中要避免反复解冻。如果峡谷个样品量的间隔时间较长，就需要重新制作标准曲线，以得保证测定的准确性。