核医学-其它体外分析+分子核进展.ppt

其它体外放射分析其它体外放射分析含意：除含意：除RIARIA之外的一切体外放射分析，之外的一切体外放射分析，但它的应用有一定局限性。但它的应用有一定局限性。一、竞争蛋白结合分析（一、竞争蛋白结合分析（CPBACPBA）：）：待分析物的结合剂：蛋白质待分析物的结合剂：蛋白质举例：举例：TBGTBG甲状腺素结合球蛋白甲状腺素结合球蛋白甲状腺素甲状腺素 CBGCBG皮质醇结合球皮质醇结合球propro皮质醇皮质醇 SHBGSHBG性激素结合球性激素结合球propro皮质醇皮质醇 内因子结合蛋白内因子结合蛋白B12B12 视蛋白视蛋白视黄醛视黄醛 蛋白激酶蛋白激酶CAMPCAMP、cGMPcGMP 牛乳蛋白酶、叶酸还原酶牛乳蛋白酶、叶酸还原酶叶酸叶酸 方法：竞争性与方法：竞争性与RIA相同相同优优点点：这这些些蛋蛋白白天天然然存存在在，来来源源丰丰富富，制备简单，省时，方法学成熟易建立。制备简单，省时，方法学成熟易建立。缺点：缺点：比比抗抗体体的的特特异异性性差差、灵灵敏敏度度也也差差，为为了了提提高高特特异异性性，须须在在样样品品制制备备上上下下功功夫。如纯化，清除干扰物等，不够方便。夫。如纯化，清除干扰物等，不够方便。该类蛋白种类有限，应用范围受限，该类蛋白种类有限，应用范围受限，已有很多被已有很多被RIA和和IRMA取代。取代。二、放射受体分析二、放射受体分析RRA RRA与与RBA的区别的区别含含义义：以以受受体体为为结结合合剂剂，利利用用竞竞争争结结合合原理对配体进行体外分析。原理对配体进行体外分析。受体的分类：受体的分类：膜膜R：一一般般为为水水溶溶性性配配体体（肽肽类类激激素素、儿儿茶茶酚胺等）酚胺等）胞胞内内R：（浆浆or核核），一一般般为为脂脂溶溶性性的的配配体体（甲状腺素，类固醇）（甲状腺素，类固醇）受体样品的制备：与受体样品的制备：与RBA相同。相同。标记品的要求：标记品的要求：要要求求配配体体标标记记前前后后生生物物活活性性不不受受影影响响。因因为为标标记记配配体体在在RRA时时活活性性往往往往是是降降低低的的。如如125I标标上上一一个个不不影影响，如果有二个响，如果有二个125I标上就有变化了。标上就有变化了。RRA的优点：的优点：1、R与与L的的结结合合反反应应快快、瞬瞬间间完完成成、比比RIA出出结结果快。果快。2、能能反反应应L的的生生物物学学活活性性。如如冬冬眠眠灵灵有有多多种种衍衍生生物物，它它们们均均能能与与特特异异抗抗体体结结合合，但但只只有有有有生生物物活活性性的的衍衍生生物物才才能能与与受受体体结结合合，这这种种测测定定反反应应L的的生生物物学学活活性性，而而不不是是免免疫疫活活性性。所所以以研研究究物物质质结结合合与与功功能能RRA占占有有相相当的地位。当的地位。RRA的缺点：的缺点：1、灵灵敏敏度度比比RIA小小10100倍倍，这这是是因因为为不不同同组组织织间间得得来来的的受受体体对对配配体体的的亲亲和和力力有有差异，又难以寻找高亲和力的受体。差异，又难以寻找高亲和力的受体。2、反反应应条条件件和和环环境境严严格格，离离子子强强度度，温度、温度、PH值要求高。值要求高。3、NSB结结合合容容量量大大，亲亲和和力力又又小小，NSB较大较大临床应用：临床应用：1、利用受体来测体内配体的含量。、利用受体来测体内配体的含量。2、测定体内抗受体抗体的量。、测定体内抗受体抗体的量。有有些些疾疾病病发发现现体体内内存存在在着着抗抗R的的抗抗体体（自自身身抗抗体体），如如Gtraves disease(TSH、甲甲状状腺腺素素R的的抗抗体体)；Insulin B型型抗抗症症（Ins R-Ab）、重重症症肌肌无无力力（乙乙酰酰胆胆硷硷受受体体抗抗体）体）。这类受体的抗体有两类特征：这类受体的抗体有两类特征：1、受受体体结结合合部部位位抗抗体体（RAb）：当当R与与Ab成成复复合合物物时时，复复合合物物中中的的R可可再再与与配配体体结结合合，即即R的的结结合合位位点点保保留留，但但复复合合物物却却抑抑制制配配体体与与单单独独存存在在的的游游离离R相相结结合。合。2、受受体体非非结结合合部部位位抗抗体体（Ab）：它它的的特特征征是是复复合合物对配体与物对配体与R的结合无抑制作用。的结合无抑制作用。三、酶的放射分析（三、酶的放射分析（REA）1、酶的活性（力）分析酶的活性（力）分析 概念：酶活性（力）：指酶催化加速反应的能力。概念：酶活性（力）：指酶催化加速反应的能力。表示法：浓度表示法：浓度/时间（反应酶促反应速度的快慢）时间（反应酶促反应速度的快慢）酶酶的的反反应应速速度度，可可以以是是底底物物的的消消耗耗量量或或产产物物的的生生成成量量 单单位位：Kat：（催催量量）指指在在规规定定条条件件下下，每每秒秒钟钟酶酶催催化化1mol底物转变所需要酶的量。底物转变所需要酶的量。旧单位：旧单位：U；1 U=16.67kat 符符号号：底底物物用用S表表示示，S*指指标标记记的的底底物物 酶酶用用E表表示示 P产物产物 反应式：反应式：*S+E E*S E*P *P+E 经过一般时间，从反应液中分离出经过一般时间，从反应液中分离出*P，测放。测放。*P的CPS酶活性（力）的计算（kat）=-SAte*P的CPS酶的比活力（kat/g）=-SAtew可知以下几个量：t（分）：*P的放射性CPS；SA标记物的比活度；e仪器效率；W参加反应的酶的蛋白量（mg）。优点优点:1、灵敏度高（放射性标记品）、灵敏度高（放射性标记品）2、特性性强，由酶的专一性决定。、特性性强，由酶的专一性决定。3、适用广，绝大多数酶可用此法。、适用广，绝大多数酶可用此法。缺点缺点:1、需高质量的定位标记物、需高质量的定位标记物2、分离方法复杂，难以自动化。、分离方法复杂，难以自动化。酶液制备酶液制备：标记物制备与选择标记物制备与选择PH、激活或抑制剂的使用、温度、时间等（自学）激活或抑制剂的使用、温度、时间等（自学）2、酶酶促促同同位位素素衍衍生生物物分分析析：实实际际上上分分析底物含量。析底物含量。反应：标记试剂反应：标记试剂+待测底物待测底物 标记衍生物标记衍生物 E举例：举例：32PrATP+胆硷胆硷 32P一磷酰胆硷一磷酰胆硷+ADP激酶激酶胆硷胆硷 衍生物的放射性强弱衍生物的放射性强弱标记试剂比活度标记试剂比活度可计算待测物量可计算待测物量（底物）（底物）注注意意：需需要要知知道道一一个个分分子子待待测测物物能能与与标标记记试试剂剂结结合合的的分子比。如果用双同位素标记可以更准确。分子比。如果用双同位素标记可以更准确。3、酶的激动剂和抑制剂测定法：、酶的激动剂和抑制剂测定法：原原理理：激激动动或或抑抑制制剂剂可可加加快快或或减减慢慢酶酶促促反反应应的的速速率率，用用系系列列浓浓度度的的激激动动或或抑抑制制剂剂与与酶酶进进行行定定时时反反应应，分分离离产产物物测测放放射射性性，可可计计算算出出激激动剂或抑制剂的量。动剂或抑制剂的量。如如磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛能能使使酪酪氨氨酸酸脱脱羧羧基基产产生生Co2，14C标标记记酪酪氨氨酸酸经经磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛作作用用产产生生14Co2，可可计算计算磷酸吡哆醛的量。磷酸吡哆醛的量。4、放射酶促饱和分析法：、放射酶促饱和分析法：与酶的底物分析相同与酶的底物分析相同 该法类同该法类同RIARIA的竞争，不同之处是的竞争，不同之处是E E不断从不断从E*SE*S和和ESES中释放出来而再去与中释放出来而再去与S S反应，如果反应时间足反应，如果反应时间足够长，因够长，因*S S与与S S为同一物，会均被转化为产物，失为同一物，会均被转化为产物，失去竞争之间的函数关系，所以不能象去竞争之间的函数关系，所以不能象RIARIA那样等待那样等待反应平衡，而应该在一定时间就得分离测定。反应平衡，而应该在一定时间就得分离测定。这是它的关键（特点之一）这是它的关键（特点之一）5，ELISAELISA：固相酶标记：固相酶标记-免疫分析免疫分析 待待测测抗抗原原固固相相化化，然然后后与与酶酶标标记记的的抗抗体体结结合合形形成成复复合合物，最后不测放射性而是让酶显色计算物质含量。物，最后不测放射性而是让酶显色计算物质含量。6、整体酶活力测定及应用、整体酶活力测定及应用二氧化碳呼气试验：二氧化碳呼气试验：用用14C或或13C等等标标记记酶酶的的底底物物，如如经经过过酶酶的的作作用用，其其产产物物中中可可收收集集到到CO2等等，反映酶活力。反映酶活力。应用：幽门螺杆菌可产生尿素酶。应用：幽门螺杆菌可产生尿素酶。如如果果胃胃内内有有幽幽门门螺螺杆杆菌菌，可可将将14C标标记记的的尿尿素素分分解解为为14CO2。因因此此有有了了呼呼气气14CO2。检测幽菌的检验。检测幽菌的检验。7、其它体外分析的新进展、其它体外分析的新进展 化学发光分析（化学发光分析（CLIA）：）：如如发发光光剂剂鲁鲁米米诺诺经经氧氧化化剂剂H2O2和和催催化化剂剂（HRP）作用下放出光子（发光）作用下放出光子（发光）特点：特点：a、用发光物质代替放素建立的免疫分析。用发光物质代替放素建立的免疫分析。b、试试剂剂盒盒稳稳定定性性更更好好，发发光光物物用用特特殊殊处处理理后后才才发发光。光。c、无放射性污染无放射性污染d、设备相对简单（仍昂贵，但设备相对简单（仍昂贵，但RIA也贵）也贵）e、发光效率与温度有关，须配备恒温设备发光效率与温度有关，须配备恒温设备f、临床上可应用项目有限，价格高于临床上可应用项目有限，价格高于RIA时间分辨荧光免疫分析（时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）概概念念：稀稀土土元元素素：稀稀土土元元素素不不是是土土,是是周周期期表表中中5771号号元元素素的的总总称称，现现又又新新发发现现二二个个钪钪、钇，共计钇，共计17个元素。个元素。如如果果用用稀稀土土元元素素标标记记化化合合物物，而而这这些些稀稀土土元元素素如如Eu（铕铕）、Tb（铽铽）Te、Sm（钐钐）、Dy（镝镝）等等可可发发射射荧荧光光，在在紫紫外外线线激激发发下下其其发发光光能能谱谱和和发发光光时时间间相相对对集集中中而而稳稳定定。而而干干扰扰因因素素的的本本底底发发光光寿寿命命很很短短，可可将将标标记记物物放放置置短短时时间间，待待本本底底光光暴暴光光后后再再去去测测量量稀稀土土荧荧光光，所所以以叫时间分辨。必要时其发光还可做些增效处理。叫时间分辨。必要时其发光还可做些增效处理。该方法优点：该方法优点：1、灵敏度高，特异性强、灵敏度高，特异性强2、出结果快、出结果快3、样品荧光能重现、样品荧光能重现4、无放射性污染、无放射性污染缺点：仪器价格贵缺点：仪器价格贵 配套试剂制备困难配套试剂制备困难免疫免疫PCR原原理理：用用DNA做做标标记记物物，用用PCR法法扩扩增增产产物物上上的的DNA，通量测定通量测定DNA的量进行定性研究。的量进行定性研究。基本反应：基本反应：1）将待测物抗原固化试管底部）将待测物抗原固化试管底部2）加入生物素标记的特异抗体）加入生物素标记的特异抗体Ab-b3）加入亲和素加入亲和素A做为连接分子做为连接分子 Ag+Ab-b+AAgAb-b-A4）再加入生物素标记的再加入生物素标记的DNA-b得得AgAb-b-A-b-DNA 引物引物 PCR扩增扩增 染色染色 记录记录PCR扩增的扩增的DNA量确定量确定Ab的含量。的含量。优点：优点：1）特异性强（与特异性强（与RIA相同）相同）2）灵灵敏敏度度高高（比比酶酶标标高高1000倍倍，也也高高于于RIA）3）操作简单操作简单缺点：缺点：1）假阳性高）假阳性高2）影响实验准确度的因素多）影响实验准确度的因素多3）未商品化）未商品化还还 有有 化化 学学 发发 光光 酶酶 免免 疫疫 分分 析析（CLEIA）p209 用用硷硷性性磷磷酸酸酶酶标标记记Ab，反反应应的的复复合合物物带带有有酶酶，加加入入底底物物金金刚刚烷烷（dioxetane phosphate）后酶促底物断裂而发光。后酶促底物断裂而发光。电化学发光免疫分析（电化学发光免疫分析（ECL）p2098、活化分析：基本原理，用粒子束（射线）照射样品，使其中待测稳定核素发生核反应变为放素，由于这些放素各具有一定的半衰期、固定的能量特征r射线或其它射线，测量其衰变出的射线能量和活度就可确定样品中各元素的种类和活度。临床应用：微量元素分析活化分析的类型：活化分析的类型：1）中活化分析：）中活化分析：a、反应堆中子活化分析（广泛）反应堆中子活化分析（广泛）b、中子高压倍加器（启动费用高）中子高压倍加器（启动费用高）c、中中子子源源，如如Ra-Be中中子子源源（Ra的的a粒粒子子轰轰击击Be可可产生中子）产生中子）d、自自发发裂裂变变中中子子源源252Cf（价价格格贵贵），将将239Pu在在反反应应堆堆照照射射二二年年吸吸收收13个个中中子子才才能能得得到到252Cf产产额额很很低。低。2）带带电电粒粒子子活活化化分分析析：一一般般将将带带电电子子粒粒子子如如P、d、a加加速速，然然后后轰轰击击待待测测元元素素，产产生生新新的的放放素素或或稳稳定核素。如定核素。如12C（p,r）13N3）r射线活化分析：较危险，目前很少用。射线活化分析：较危险，目前很少用。活化分析的优点：活化分析的优点：灵敏度高灵敏度高10-9克左右克左右没有试剂污染没有试剂污染可进行非破坏性分析可进行非破坏性分析一次可同时分析几十种元素一次可同时分析几十种元素缺点：缺点：精确度低精确度低有干扰反应（副反应）有干扰反应（副反应）方法不易普及方法不易普及不能测化合物的量和结构。不能测化合物的量和结构。最常用的计算公式（相对测量法）最常用的计算公式（相对测量法）WX AX -=-WS AS8、质子激发、质子激发X线发射分析线发射分析PIXEA 原原理理：用用高高速速运运动动的的质质子子轰轰击击待待测测元元素素，待待测测元元素素原原子子核核外外电电子子被被击击出出，留留下下的的空空穴穴将将被被外外层层电电子子来来填补，多余的能量以特征填补，多余的能量以特征X线放出。线放出。特特征征（产产生生射射线线的的能能量量与与入入射射粒粒子子无无关关，它它只只与与被被测测元元素素的的种种类类有有关。不同的元素产生不同的特征关。不同的元素产生不同的特征X线。线。分子核医学进展分子核医学进展内涵：利用示踪技术观察体内的生化过内涵：利用示踪技术观察体内的生化过程并与相关基因联系起来的一门分支学程并与相关基因联系起来的一门分支学科科，分子识别是其重要理论基础。分子识别是其重要理论基础。研究领域：受体显像研究领域：受体显像 基因显像基因显像 重组单抗片段、肽类放射性药重组单抗片段、肽类放射性药物及微型抗体。物及微型抗体。特特 点点 1）深入分子水平认识疾病，）深入分子水平认识疾病，通过细胞信息传导、基因表达、通过细胞信息传导、基因表达、生化代谢等多个方面，在解剖学生化代谢等多个方面，在解剖学和功能症状出现之前发现病变信息。和功能症状出现之前发现病变信息。2）通过特定示踪剂，将疾病与基因表达的改变）通过特定示踪剂，将疾病与基因表达的改变联系起来，提高疾病诊治的层次。联系起来，提高疾病诊治的层次。3）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。4）分子识别是分子核医学的理论基石。）分子识别是分子核医学的理论基石。5）生化代谢的评价是其理论重要组成部分）生化代谢的评价是其理论重要组成部分