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金免疫分析技术2021/10/101主要内容主要内容1、胶体金的制备原理、方法、注意事项、质量鉴胶体金的制备原理、方法、注意事项、质量鉴定、胶体金保存定、胶体金保存2、免疫金的制备原理、技术要点免疫金的制备原理、技术要点3、免疫金免疫金 测定技术测定技术斑点金免疫渗透试验的原理、技术类型斑点金免疫渗透试验的原理、技术类型斑点金免疫渗透试验的原理、技术类型斑点金免疫渗透试验的原理、技术类型斑点金免疫层析试验的原理、技术要点斑点金免疫层析试验的原理、技术要点斑点金免疫层析试验的原理、技术要点斑点金免疫层析试验的原理、技术要点临床应用及评价临床应用及评价临床应用及评价临床应用及评价2021/10/102 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（goldsol），是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。什么叫胶体金什么叫胶体金3zeta电位可以使胶体金颗粒之间相互排斥，以维持胶体金的稳定状态。基础金核双离子 内层负离子（AuC12）zeta电位 外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中4胶体金的制备胶体金的制备制备原理制备原理还原法还原法：用一定量的还原剂把一定浓度的金用一定量的还原剂把一定浓度的金盐溶液还原成金离子。盐溶液还原成金离子。常用的金盐是氯金酸常用的金盐是氯金酸还原剂是枸橼酸钠、鞣酸、维生素还原剂是枸橼酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、白磷、硼氢化钠硼氢化钠5胶体金的制备胶体金的制备制备方法制备方法氯金酸水溶液加热沸腾搅拌着加入枸橼酸钠水溶液 金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色 再煮沸15min冷却后以蒸馏水恢复到原体积6胶体金的制备胶体金的制备注意注意事项事项1 1）、玻璃容器的清洁容器使用前必须酸洗和硅化）、玻璃容器的清洁容器使用前必须酸洗和硅化硅化的一般过程硅化的一般过程 用用5%5%的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器1min1min，室温干燥后，用蒸馏水冲洗，在干燥备用。，室温干燥后，用蒸馏水冲洗，在干燥备用。2 2）、试剂、水质和环境）、试剂、水质和环境 使用氯金酸时不能用金属药匙，避免使用氯金酸时不能用金属药匙，避免接错天平秤盘接错天平秤盘双蒸馏水，实验室尽量无尘双蒸馏水，实验室尽量无尘pHpH值值3.03.05.85.8的柠的柠檬酸磷酸盐、檬酸磷酸盐、pH5.8pH5.88.38.3的的Tris-HCLTris-HCL和和pHpH值值8.58.510.310.3的硼酸氢氧的硼酸氢氧化钠等缓冲容量大的缓冲系统，但应控制浓度不要太高化钠等缓冲容量大的缓冲系统，但应控制浓度不要太高7胶体金的制备胶体金的制备质量鉴定和胶体金保存质量鉴定和胶体金保存质量鉴定质量鉴定外观检查外观检查 清亮透明悬液清亮透明悬液颗粒大小与均一性检查颗粒大小与均一性检查 肉眼观察或肉眼观察或分光光度计扫描或者电镜检查分光光度计扫描或者电镜检查胶体金保存胶体金保存 洁净玻璃器皿，放入少洁净玻璃器皿，放入少量防腐剂，少量分装备用量防腐剂，少量分装备用8免疫金免疫金制备制备胶体金与抗胶体金与抗原抗体等大原抗体等大分子物质结分子物质结合形成合形成制制备备原原理理将蛋白质吸附到胶体金颗粒表面将蛋白质吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程而结合的过程环境环境pH值和离子强度是影响吸附值和离子强度是影响吸附的主要因素的主要因素9免疫金的制备免疫金的制备技技术术要要点点胶体金溶液胶体金溶液pH值的调配值的调配0.2molLK2CO3或者或者0.1molLHCl调整到标记调整到标记蛋白质带等电点货稍偏碱。蛋白质带等电点货稍偏碱。通常要经多次试验通常要经多次试验。蛋白质最适用量的确定蛋白质最适用量的确定用标记蛋白质作系列稀释，用标记蛋白质作系列稀释，分别取分别取0.1ml0.1ml蛋白质稀释液加蛋白质稀释液加入入1ml1ml胶体金溶液中，并设不胶体金溶液中，并设不加蛋白质的对照管加入加蛋白质的对照管加入10%NaCl10%NaCl溶液溶液0.1ml0.1ml混匀、静混匀、静置置2 2小时。选以红色不变管中小时。选以红色不变管中蛋白质含量最低为稳定蛋白质含量最低为稳定1ml1ml胶胶体金所必需蛋白质的量。体金所必需蛋白质的量。胶体金的标记胶体金的标记按照最适比，在电磁按照最适比，在电磁搅拌下将所需要量的搅拌下将所需要量的胶体金加入一定量的胶体金加入一定量的蛋白质溶液中，加入蛋白质溶液中，加入一定量的稳定剂，调一定量的稳定剂，调整整pHpH至至8.58.5，离心，离心，轻吸上清液，用缓冲轻吸上清液，用缓冲液悬浮，恢复原体积液悬浮，恢复原体积后再离心，重复操作后再离心，重复操作2 2、3 3次。次。胶体金结合物的胶体金结合物的纯化与鉴定纯化与鉴定纯化：超速离心法纯化：超速离心法和凝胶过滤法和凝胶过滤法鉴定：电镜测定颗鉴定：电镜测定颗粒的平均直径以及粒的平均直径以及免疫组化滤纸模型免疫组化滤纸模型测定结合物的特异测定结合物的特异性、敏感性性、敏感性保存保存用稀释液配制用稀释液配制成工作浓度保成工作浓度保存存10金免疫测定技术分类金免疫测定技术分类斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验 DIGFA（dot immuno-gold filtration assaydot immuno-gold filtration assay）斑点金层析试验斑点金层析试验 DICA（dot immunogold chromatographic assay）11DIJFA将抗原抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制将抗原抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上成抗原抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上标本中的抗原抗体被膜上的抗体抗原捕获，无关蛋标本中的抗原抗体被膜上的抗体抗原捕获，无关蛋白随液体滤出白随液体滤出 加入胶体金标记物在渗滤中与相应的抗原抗体结合。加入胶体金标记物在渗滤中与相应的抗原抗体结合。阳性反应：膜上呈现红色斑点阳性反应：膜上呈现红色斑点斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验原理原理12斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验13技术类型技术类型 DIGFA双抗体夹心双抗体夹心法测抗原法测抗原DIGFA-间接法测抗体间接法测抗体抗体结合在微孔滤膜抗体结合在微孔滤膜的中央的中央 加待测标加待测标本本 加金标抗体加金标抗体 洁洗涤剂后，洁洗涤剂后，阳阳性结果，膜中央呈现性结果，膜中央呈现红色斑点红色斑点 抗原包被在微孔滤膜抗原包被在微孔滤膜上上滴加待测标本滴加待测标本加洗涤剂后滴加加洗涤剂后滴加金标抗抗体加洗涤金标抗抗体加洗涤剂后，剂后，阳性结果，膜中阳性结果，膜中央呈红色斑点央呈红色斑点斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验14DIGFA-间接法测抗体间接法测抗体阳性阳性阴性阴性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待测待测抗体抗体金标二抗人金标二抗人人人IgGIgG斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验15DIGFADIGFA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原AB操作：加样操作：加样A；加加金标记物金标记物；洗涤洗涤B，观察观察具体步骤如下：（1 1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本A 1A 12 2滴，待完全渗入。滴，待完全渗入。（2 2）于小孔内滴加金标记物物试剂）于小孔内滴加金标记物物试剂1 12 2滴，待完全渗入。滴，待完全渗入。（3 3）于小孔内滴加洗涤液）于小孔内滴加洗涤液B 2B 23 3滴，待完全渗入。滴，待完全渗入。（4 4）判读结果：）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验16 原理和免疫渗透试验相同。原理和免疫渗透试验相同。不同在一个是穿流一个是横流。不同在一个是穿流一个是横流。DICA原理原理斑点金层析试验斑点金层析试验17斑点金层析试验图示斑点金层析试验图示斑点金层析试验斑点金层析试验18DIGFA 穿流（flow through）DICA 横流（lateral flow）斑点金层析试验斑点金层析试验19方法分类方法分类双抗体夹心法双抗体夹心法测抗原测抗原 间接法间接法测抗体测抗体 竞争法竞争法测抗原测抗原斑点金层析试验斑点金层析试验20C 阴性B 阳性DICA-DICA-双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原斑点金层析试验斑点金层析试验21DICA-间接法测抗体间接法测抗体C 阴性B 阳性斑点金层析试验斑点金层析试验22阴性弱阳性阳性DICA竞争法测抗原竞争法测抗原检测线颜色强度与SD浓度负相关斑点金层析试验斑点金层析试验23临临床床应应用用及及评评价价金免疫测定技术金免疫测定技术检测检测HCGHCG，AFPAFP、轮状病毒、轮状病毒、A A族链球族链球菌、衣原体等抗原。抗菌、衣原体等抗原。抗HCVHCV、抗、抗HIVHIV、抗弓形虫，抗巨细胞病毒等抗体。抗弓形虫，抗巨细胞病毒等抗体。优点优点快速简便、单份测定、无仪器设快速简便、单份测定、无仪器设备需要、试剂盒样品用量极少，操作备需要、试剂盒样品用量极少，操作人员不需要技术培训人员不需要技术培训缺点缺点 灵敏度差，只能进行定性或半灵敏度差，只能进行定性或半定量定量24谢谢谢谢25