分子诊断1-2.ppt

分子诊断研究策略主讲：买制刚主讲：买制刚2345n人人的的23对对染染色色体体6789连键：3，5-磷酸二酯键方向：3-末端5-末端核酸的一级结构10构成核酸密码的四种碱基n腺嘌呤：缩写An鸟嘌呤：缩写Gn胸腺嘧啶：缩写Tn胞嘧啶：缩写Cn四种碱基两两配对：A-T,G-C11n5-TGCAGGTTAAAGG-3n它的互补链它的互补链:n3-ACGTCCAATTTCC-5121.嘌呤与嘧啶的摩尔数相等：A=T；G=C；A+G=C+T2.DNA的碱基组成具有种的特异性3.DNA的碱基组成没有组织的特异性4.年龄、营养状态、环境的改变不影响DNA的碱基组成13 1953年Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构模型1415核酸的分布nDNA：细胞核（98%）、线粒体、叶绿体nRNA：细胞核、细胞质1.rRNA：核仁中合成，占总RNA的80%2.tRNA：核内合成，占总RNA的15%3.mRNA：核内合成，占总RNA的5%161718什么是分子诊断？n传统的诊断：宏观微观，大小，外里n分子诊断：微观，生物大分子是构成机体和参与生命活动的主要成份。1920分子诊断学的概念n概念:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防，诊断、治疗和转归提供信息和依据。2122分子诊断学的概念、任务和特点n任务:探讨疾病的发生、发展和转归的分子机制；为整个疾病过程寻求准确、特异的分子诊断指标；利用分子生物学技术为这些诊断指标建立临床实用、可靠的检测方法。n特点:病因学诊断，不仅有描述性更具有准确性；基因型变异、基因表型异常、外源基因引起的疾病。23分子诊断的发展n1953年Watson和Crick提出脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型。n1978年，简悦威（Yuet Wai Kan)，液相DNA分子杂交检测镰形细胞贫血症。诞生。n1985年，Mullis，PCR技术创建标志分子诊断进入第二阶段。n2001年，基因组序列图谱公布，蛋白质组学进步，生物芯片为代表高通量技术，第三阶段。n2005年，正式提出分子诊断学。24分子诊断的研究对象和策略n诞生于分子生物学n研究生物大分子，进一步发展，适用于围绕中心法则产生的生物大分子，即核酸和蛋白质。n策略：以生物中心法则为指导，利用分子诊断技术来判断疾病基因结构异常或基因表达异常。25 中心法则(genetic central dogma)，是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充。2627分子诊断的研究对象、策略和内容28分子诊断的范围n狭义的分子诊断仅指基因诊断。n广义的分子诊断，不但包括基因诊断，还包含对蛋白质等所有生物大分子的诊断。n从早期的单一疾病的诊断发展到易感性判断以及提供临床用药指导等。29分子诊断在医学中的应用n感染性疾病的分子诊断n遗传性疾病的分子诊断n肿瘤的分子诊断n个体化医疗n其他：耐药性、疗效监控、卫生防疫、法医等。体外诊断试剂盒30分子诊断的现状及在医学中的应用n感染性疾病的分子诊断 病原微生物感染导致的疾病，仍然是严重威胁人类健康的一个重要方面。传统的病原体检测（微生物学检测、免疫学检测和血液学检测），不易早期诊断，并受到灵敏度限制。例如：肝炎系列、HIV，以及近年来一些严重的传染病疫情方面，分子诊断都发挥了重要的作用。31分子诊断的现状及在医学中的应用n遗传性疾病的分子诊断 目前发现的人类遗传性疾病有数千种，分为两大类：符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病和不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（多因素遗传病）。传统的遗传疾病的诊断方法是以疾病的表形病变为依据，而表形易受外界的影响，这影响了诊断的准确性和可靠性。而遗传性疾病的分子诊断是通过分析患者的DNA、RNA、染色体、蛋白质和某些代谢产物来揭示与该遗传病发生相关的基因、基因型、基因突变、基因的单倍体型和染色体核型等生物学标记，具有准确可靠、早期诊断的优势，并利于对遗传病的预防。32分子诊断的现状及在医学中的应用n肿瘤的分子诊断 肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移、判断疗效和预后以及人群普查等方面有较大的使用价值。肿瘤标志分为基因型标志和基因表型标志：基因型标志指基因本身突变和表达异常，能反映癌前启动阶段的变化；基因表形标志指基因表达产物异常，表达产物合成紊乱，出现较晚。寻找特异性的肿瘤基因型标志进行肿瘤的分子诊断，对肿瘤的早期发现和诊断，以及肿瘤的预防和治疗具有至关重要的意义。33分子诊断的现状及在医学中的应用n个体化医疗 是指针对可能影响患者治疗效果的个体因素（基因）和环境因素，做出适合不同患者的最佳处理和治疗方案。基因组学、药物基因组学、药物蛋白质组学、以及药物代谢组学。3435分子诊断的现状及在医学中的应用n其他：耐药性、疗效监控、卫生防疫、法医等。对多基因疾病易感性的判断和诊断。亲子鉴定 甄别犯罪分子 36体外诊断试剂盒的国内外现状 体外诊断试剂是生物医药的重要组成部分。国外：n2006年，全球体外诊断产品产值200亿美元。n700种体外诊断制品应用于临床。国内：n2010年，市场产值近150亿n约400个品种的诊断试剂运用于临床。37全球体外诊断试剂市场分布 份额北美42%欧盟30%日本9%中国3%其它16%38体外诊断试剂的国内外知名企业国外：n罗氏n雅培国内：n科华生物n达安基因39几个分子诊断的常用术语n灵敏性（度）：是指诊断方法能将实际有病的人正确地判定为患者的比例。n特异性（度）：是指诊断方法能将实际无病的人正确地判定为非患者的比例;n精密性（度）：一组相同的试验的数据相互之间的接近程度。可重复性的指标。40分子诊断试剂盒的研究策略n确定检测的目的物n筛选并确定检测的检材和样品n筛选并确定检测的方法n检测过程优化n结果分析方法n建立试剂盒质量标准n申请批准文号41分子诊断常用检测方法简介分子诊断核酸检测蛋白检测核酸分子杂交：Southern B.FISH聚合酶链反应（PCR)DNA测序基因芯片免疫学检测：免疫组织化学、ELISA、胶体金、化学发光、时间分辨免疫检测等蛋白质芯片42核酸分子杂交技术43DNA的变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。热变性酸碱变性化学试剂变性44DNA的复性（renaturation)：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。454647探针48利用核酸分子杂交进行分子诊断的策略n利用核酸变性和复性的性质，用已知序列的核酸链检测其互补序列。n杂交形式：DNA与DNA之间；RNA与DNA之间。n探针：把已知的核酸链连接上可被检测到的物质。探针的种类：放射性核素标记和非放射性标记。放射性核素：32P、35S、3H、125I 非放射性标记：生物素、地高辛、光敏生物 素、荧光素(异硫氰酸荧光素、罗丹明）等 49探针的特点：n高度特异性n长度：不同种类的探针所要求的长度不同，基因组探针几百碱基以上，寡核苷酸探针一般2050nt。n碱基成份：GC含量（4060%），不应存在互补序列（大于4bp)，以免形成“发卡”结构，避免同一碱基重复出现。n一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。50核酸分子杂交常见类型和应用举例n常见技术类型：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。n具体应用：例荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）51荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）n原位：在组织、细胞或染色体上的原来的位置上显示出来。n原位杂交条件及步骤：将组织切片（细胞）固定、处理、加探针反应，洗涤，显微镜观察标记物。52荧光原位杂交（FISH）检测HER-2n致癌基因：致癌基因：Her-2基基因；因；n 位点：位点：17q11.2-q12；n 编码蛋白：跨膜蛋白编码蛋白：跨膜蛋白（与表皮生长因子受（与表皮生长因子受体部分同源）；体部分同源）；n 25-30%乳腺癌病人乳腺癌病人都有都有HER-2的扩增；的扩增；53检测HER-2的意义nHER-2作为预后的指标：Her-2蛋白过度表达病人中，5年生存率28，而Her-2阴性者则为71。HER-2基因扩增与乳腺癌患者无瘤生存期和总体生存期显著缩短相关。nHER-2作为化疗方案的选择和反应的预测指标：近期研究发现，HER-2高表达的乳腺癌患者对CMF联合化疗、三苯氧胺治疗以及单独的激素疗法产生耐受，而对泰索帝(docetaxel,taxotere)、含蒽环类药物（阿霉素、表阿霉素）的治疗则更敏感。nHER-2作为治疗的靶点：Herceptin对Her-2基因扩增（HER-2蛋白高表达）的患者有明确的疗效。54荧光原位杂交（FISH）检测HER-2用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交原理5556荧光原位杂交在其他检测方面的应用n检测HPVn检测染色体数目（唐氏综合症）n检测其他肿瘤（实体瘤、喉癌、骨髓瘤等等）57分子诊断关于极微量核酸的检测 -聚合酶链反应（PCR)58PCR用于核酸检测的意义n感染性疾病的早期诊断n遗传疾病的诊断n药物的疗效观察n疾病的发病监控5995模板DNAnPCR的原理：60PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物nPCR的原理：61PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶nPCR的原理：62PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始nPCR的原理：63PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqnPCR的原理：64PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束nPCR的原理：65PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增66PCR的 特点n灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌n简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA67PCR的类型n类型：巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、重组PCR、锚定PCR、不对称PCR、反向PCR、免疫PCR、原位PCR、荧光定量PCR等。68荧光定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，每扩增出一条链就会产生一个荧光信号，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。69qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量2570PCR的应用1.研究：基因克隆，DNA测序，分析突变2.诊断：细菌、病毒、寄生虫检测，诊断3.人类基因组工程：遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱4.法医：犯罪现场标本分析5.肿瘤：各种肿瘤检测6.其他71传染疾病的PCR检测肝炎病毒：HAV、HBV、HCV、HDV、HEV艾滋病毒：HIV流感病毒：H1N1、H5N1等性病检测：支原体（UU）、衣原体（CT）、淋球菌（NGH）、人乳头瘤病毒（HPV）人畜共患病：口蹄疫病毒、禽流感病毒等SARS病毒等等。72PCR:Viral detection73实时荧光定量PCR仪74分子诊断关于高通量大规模检测的策略 -生物芯片75生物芯片是需求的产物n基因组学、蛋白质组学的需求。n在医院里疲于奔命的血液检查，没完没了：周期长，抽血多，费用大。n如何从数十万种化合物中迅速有效筛选出药物前体？n战争中遇见不明致病致命微生物，如何迅速确定？n海关检查一批外来生物入侵物品，怎样在规定时间内迅速筛查，发现违禁生物物种？76生物芯片分类n微阵列芯片：基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。n微流控芯片：样品制备芯片、聚合酶链反应（PCR）芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等。n芯片实验室：完成诸如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作。7778基因芯片n基因芯片指对数以千记的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等（Trends in Biotechnology)。n该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。7980基因芯片的特点n 技术操作简单 n 自动化程高n 序列数量大n 检测效率高n 应用范围广n 成本相对低81基因芯片的主要类型n从点阵的制备方法来分从点阵的制备方法来分主要有两类：原位合成型与“点膜”型。n 原位合成型 指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：光引导原位聚合技术与压电打印原位聚合技术。82点膜型 合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型公司所采用的方法。优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高 缺点：点阵密度低83生物芯片工作示意图84基因芯片在分子诊断方面的主要应用n 遗传疾病的检测：遗传性耳聋基因检测芯片、类风湿关节炎n耐药性检测：分枝杆菌菌种鉴定基因芯片和结核耐药基因检测芯片等用于临床检验n传染性疾病的检测：HPV芯片、HCV分型、肿瘤筛查芯片等等n 突变检测：-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等检测n个体化医疗：单核苷酸突变、耐药基因检测等85检测蛋白质的策略检测蛋白质的策略86蛋白质检测n蛋白质组学方法 质谱、双相电泳、毛细管电泳、电镜、X光衍射等研究蛋白质性质、结构的方法n利用蛋白质的相互作用 免疫学方法：检测蛋白质是否存在的较为简单的方法。特别是检测致病微生物。87免疫学知识n抗原：一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质。n抗体：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（Ig)。分为5大类：IgM、IgG、IgA、IgD、IgE n抗原抗体的特异反应 Ag +Ab Ag-Ab8889常用免疫学检测技术的策略n免疫印迹技术（Western Blot）-科研常用n酶联免疫吸附实验（ELISA)-简单实用，定性检测n化学发光（荧光）免疫检测-灵敏、定量检测n免疫层析检测技术-简单、快速、方便 90酶联免疫吸附实验（ELISA)n是将抗原和抗体的特异性反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。n 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。n是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）。）。常用底物：常用底物：TMBTMB、OPDOPD、DABDAB等等91双抗体夹心检测抗原双抗体夹心检测抗原nAg +Ab1 Ag-Ab1nAg-Ab1+AbE*Ab1-Ag-AbE*92939495ELISA的特点n灵敏n特异n简单方便nTMB为底物的吸光光度法，方法成熟n成本低n可自动化96ELISA的临床应用n传染性疾病的检测：HBV两对半、HCV抗体检测、性病系列、HIV等n优生优育系列：TORCH系列试剂盒等n肿瘤标志物：AFP、CEA、PSA等n兽医检测97化学发光免疫检测技术与放免、ELISA相比主要是标记物或底物不同，标记物主要有两类：n 直接检测标记物：Luminol、吖啶酯等n 酶标记物：HRP、ALP等底物不同：nHRP底物：Luminol等nALP底物：金刚烷氨类98化学发光免疫检测技术的优势n灵敏度更高：可达pg级或pmol级。ELISA为ng级。n定量范围更宽：达到45个数量级，ELISA只有23个数量级。n无环境污染：相对于放免说。n操作简便、可自动化操作99化学发光化学发光酶免疫测定酶免疫测定技术反应原理图技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清100 四、临床应用四、临床应用n1.甲状腺激素n 2生殖激素n 3垂体激素和皮质激素n 4贫血因子n 5肿瘤标志物 n 6感染性疾病n 7糖尿病 胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素等。n 8心脏标志物n 9病毒标记物n 10过敏性疾病n 11治疗药物浓度监测101层析法技术优势:简单现场快速1.打开包装取出试纸条2.直接插入待测样品中 3.目测读出结果（3-10分钟内）102与常规诊断方法相比：优点优点缺点缺点快速：全部检测过程仅需 3-10分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种检查定量问题灵敏度问题103试纸条组成结构测试线测试线 （T线）线）控制线（控制线（C线）线）胶体金垫胶体金垫吸水滤纸吸水滤纸样品垫样品垫NC膜（硝酸纤维素膜）膜（硝酸纤维素膜）层析方向层析方向PVC底板底板104免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心）（以HCG检测为例）105106技术应用类别类别应用领域应用领域检测的物质检测的物质人类医学人类医学各级医院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,兽瘟疫等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食品安全食品安全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素三聚氰胺107Thanks!108