CHO细胞表达抗体-(1).ppt

CHO细胞表达抗体细胞表达抗体2021/3/29 星期一1基因工程抗体表达体系基因工程抗体表达体系CHO CHO 细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞2021/3/29 星期一2CHO（Chinese hamster ocary）CHO细胞生物技术产业化的首选细胞系目前70%以上的治疗性抗体蛋白都是由CHO细胞产生的u对蛋白质进行糖基化，其糖型与人类基本一致糖型与人类基本一致u不易传播人类病毒不易传播人类病毒，比其他哺乳细胞基因组更容易进行改造和扩增u遗传背景清楚、转染效率高、可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体u利于抗体纯化：非分泌型细胞非分泌型细胞，本身很少分泌内源性蛋白；可用无血清培养2021/3/29 星期一3CHO Classification补充补充：1980年CHO-K1经化学突变得到CHO-DXB11（一个等位基因缺失）1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44 （两个等位基因缺失）由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻底，很快被完全无DHFR活性 的CHO-DG44取代注释注释：ATCC （American Type Culture Collection）美国菌种保藏中心 ECACC（European Collection of Authenticated Cell Cultures）欧洲细胞株/微生物保藏中心2021/3/29 星期一4DHFR缺陷型宿主细胞野生型宿主细胞DG44DG44DUXB11CHO-K1CHO-K1CHO-SCHO-SPcDNA3.3/Poptivec载体系统Life Technology公司GSGS基因表达系统基因表达系统瑞士的Lonza公司DHFRDHFR基因表达系统基因表达系统Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主细胞：DG44质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR标记基因，￥3500）筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主细胞：CHO-K1SV质粒：PEE12.4（Amp抗性，GS标记基因，￥2000）筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）宿主细胞：CHO-s Cells(cGMP-banked)质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标记基因，￥10000）筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO CellCHO Cell2021/3/29 星期一5抗体真核高效表达策略抗体真核高效表达策略作用环节相应策略整合位点弱化选择标致基因；染色体定位筛选基因剂量弱化的可扩增选择标志基因转录强启动子、增强子、强转录终止信号、适宜的抗体基因结构翻译翻译型增强子，适宜的抗体基因结构加工组装轻重链表达平衡，宿主细胞修饰分泌适宜的抗体分泌前导肽，适宜的抗体基因结构其他选择适宜的宿主细胞、宿主细胞修饰，尽量去除非生产性克隆抗体mRNA的转录、转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素因此，抗体的表达量很大程度上由质粒载体的各表达调控元件及组织方式决定2021/3/29 星期一6CHO表达载体组成表达载体结构组成u 骨架序列u 选择性标志基因选择性标志基因u 表达盒表达盒u 特殊的调控序列2021/3/29 星期一7选择标志基因选择标志基因当环境中存在高浓度（MTX、MSX）时，标记基因可自发在染色体上扩增拷贝数，连带其上下游的序列一起扩增，共扩增序列可达上千个bp，拷贝数可增加几百到几千倍。对目的基因的拷贝数没有影响，如主要用于构建瞬时表达载体。2021/3/29 星期一8表达盒抗体基因表达盒的组织形式抗体基因表达盒的组织形式已较为固定，但其中各元件已较为固定，但其中各元件的选择仍有值得探讨的地方的选择仍有值得探讨的地方启动子和相应的增强子是最关键的元件真核启动子含有TATA盒（确定转录起始位点）和下游富含GC的序列（决定转录起始频率）常用的CHO细胞表达启动子的转录活性依次为CMV启动子 SV40 启动子 LTR启动子2021/3/29 星期一9 常用的较早的商业化载体常用的较早的商业化载体系统系统适用于适用于DHFRDHFR缺陷细胞，缺陷细胞，但是有报道但是有报道CHOCHO（DHFR-)DHFR-)细胞，很难驯化，生长也细胞，很难驯化，生长也不好。不好。DHFRDHFR系统表达水平虽系统表达水平虽较较GSGS系统低，但细胞系统低，但细胞生长稳定生长稳定新近发展的更有效的新近发展的更有效的系统系统具有更高的扩增效率，具有更高的扩增效率，但细胞长期连续培养但细胞长期连续培养时，生长状况不佳。时，生长状况不佳。2021/3/29 星期一10PcDNA3.3/Poptivec载体系统载体系统 将右图质粒共转染将右图质粒共转染CHOCHO（DHFR-DHFR-）u宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长u重组质粒Poptivec-target整合到宿主菌染色体组上后的阳性菌可在不含GHT的培养基中生长。u进一步用G418和MTX筛选，在MTX浓度选择压力下，dhfr基因与其共转染的目的基因一起扩增，提高目的蛋白表达。2021/3/29 星期一11GS系统Sigma、药明康德等公司都在自己构建载体使用（只要知道载体的几个原件可以自己全部合成）宿主细胞：CHO-K1质粒：PEE12.4筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）瑞士的瑞士的LonzaLonza公司公司 1992年，Bebbington等首次使用GS基因细胞系统表达重组抗体 PEE12.42021/3/29 星期一12PEE12.4PEE12.4412.42021/3/29 星期一13GS（谷氨酰胺合成酶）筛选原理L-谷氨酸+氨+ATP L-谷氨酰胺+ADP+PiGS2021/3/29 星期一14 DHFR系统宿主宿主：CHO-S Cell（cGMP-banked）培液培液：CD-FortiCHO Medium 限制性内切酶限制性内切酶：AvrII/BstZ17I ，EcoRV/Pacl线性化酶线性化酶：NruI转化转化：Neon electroporation Transfection筛选试剂筛选试剂：Puromycin/MTX筛选方法筛选方法：两轮加压筛选单克隆筛选单克隆筛选：有限稀释法2021/3/29 星期一15u四氢叶酸是一碳单位的载体，在核苷酸的合成中起到重要作用。u当叶酸类似物MTX不可逆结合后，阻止四氢叶酸合成。细胞必须产生更多的DHFR才能维持细胞代谢。DHFR（二氢叶酸还原酶）筛选原理2021/3/29 星期一162021/3/29 星期一17CHO细胞的培养细胞的培养一般采用F12培养基培养含10血清的常规培养基里培养无血清培养基2021/3/29 星期一18 基因合成与质粒构建（密码子优化）2-3weeks 转化大肠杆菌TOP10 1-2 weeks 转染CHO-s 2days 细胞pool筛选 6-8weeks 单克隆Cell筛选 4-5weeks 单克隆扩增、评估 2-3weeks 扩大培养2021/3/29 星期一192021/3/29 星期一20u小梯度多次加压有利于最终得到稳定的高表达细胞株。u大幅度加压可以在短期内得到高表达克隆株细胞，但是细胞株表达不稳定，在撤掉筛选压力后，表达水平往往下降。2021/3/29 星期一21THEENDTHANK YOU THANK YOU！2021/3/29 星期一22