基因工程的基本操作程序.ppt

1-基因工程培育抗虫棉的基因工程培育抗虫棉的简要要过程：程：提取提取提取提取棉花棉花细胞胞(含含抗虫基因抗虫基因)苏苏云金芽云金芽云金芽云金芽孢孢杆菌杆菌杆菌杆菌抗虫基因抗虫基因与运与运与运与运载载体体体体DNADNADNADNA拼接拼接拼接拼接导导入入入入普通棉花普通棉花普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)2-基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n（1）目的基因的）目的基因的获取取n（2）n（3）将目的基因）将目的基因导入受体入受体细胞胞n（4）目的基因的）目的基因的检测与与鉴定定基因基因表达表达载体体的构建的构建3-一、目的基因的一、目的基因的获取取1、目的基因：主要指的是、目的基因：主要指的是编码蛋白蛋白质的的结构基因构基因，也可以是一些具有，也可以是一些具有调控作用的因控作用的因子。子。2、获取方法：取方法：（1）从）从基因文基因文库中中获取目的基因；取目的基因；（2）利用）利用PCR技技术扩增目的基因；增目的基因；（3）通）通过DNA合成合成仪用化学方法直接合成用化学方法直接合成4-（一）从基因文（一）从基因文库中中获取目的基因取目的基因1.什么叫基因文什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的将含有某种生物不同基因的许多多DNA片断，片断，导入到入到受体菌的群体受体菌的群体中，中，各个受体菌分各个受体菌分别含有含有这种生物的不同基种生物的不同基因，称因，称为基因文基因文库。基因文基因文库 基因基因组文文库部分基因文部分基因文库（cDNA文文库）5-基因基因组DNADNA文文库cDNAcDNA文文库基因基因组DNADNA文文库与与cDNAcDNA文文库的比的比较6-补：原核：原核细胞的基因胞的基因结构构非非编码区区非非编码区区编码区区编码区上游区上游 编码区下游区下游 与与RNARNA聚合聚合酶结合位点合位点启启动子子终止子止子 RNARNA聚合聚合酶能能够识别调控序列中的控序列中的结合位点，合位点，并与其并与其结合。合。转录开始后，开始后，RNARNA聚合聚合酶沿沿DNADNA分子移分子移动，并以并以DNADNA分子的一条分子的一条链为模板合成模板合成RNARNA。转录完完毕后，后，RNARNA链释放出来，放出来，紧接着接着RNARNA聚合聚合酶也从也从DNADNA模板模板链上脱落下来。上脱落下来。7-不能不能转录为信使信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白蛋白质。：能：能转录相相应的信使的信使RNARNA，能，能 编码蛋白蛋白质 编码区区非非编码区区原核原核细胞胞的的 基因基因结构构有有调控控遗传信息表达的核信息表达的核 苷酸序列，在苷酸序列，在该序列中，序列中，最重要的是位于最重要的是位于编码区上区上 游的游的RNARNA聚合聚合酶结合位点。合位点。非非编码区区非非编码区区编码区区编码区上游区上游 编码区下游区下游 启启动子子终止子止子8-补：真核：真核细胞的基因胞的基因结构构编码区区非非编码区区非非编码区区与与RNARNA聚合聚合酶结合位点合位点内含子内含子 外外显子子 能能够编码蛋白蛋白质的序列叫做外的序列叫做外显子子 不能不能够编码蛋白蛋白质的序列叫做内含子的序列叫做内含子启启动子子终止子止子编码区上游区上游 编码区下游区下游 内含子：内含子：外外显子：子：9-真真核核细胞胞的的 基基因因结构构编码区区非非编码区区外外显子：能子：能编码蛋白蛋白质的序列的序列内含子：不能内含子：不能编码蛋白蛋白质的序列的序列：有：有调控作用的核苷酸序列，控作用的核苷酸序列，包括位于包括位于编码区上游的区上游的RNARNA 聚合聚合酶结合位点。合位点。非非编码序列：序列：包括非包括非编码区和内含子区和内含子10-结构基因构基因外外显子子内含子内含子转录、加工修、加工修饰mRNA11-原核原核细胞与真核胞与真核细胞的基因胞的基因结构比构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白相同数目氨基酸的蛋白质，原核，原核细胞与真核胞与真核细胞基因胞基因结构一构一样长吗？连续不不连续编码区区非非编码12-基因表达的基因表达的计算算n n在真核生物中，在真核生物中，对应的是的是 的碱基数的碱基数DNAmRNA蛋白蛋白质转录翻翻译631氨基酸数氨基酸数碱基数碱基数基因中外基因中外显子子13-基因基因组文文库与与部分基部分基因文因文库的关系的关系14-基因基因基因基因组组文文文文库库和部分基因文和部分基因文和部分基因文和部分基因文库库的比的比的比的比较较小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以15-基因文库与基因库 基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因文库与基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。16-基因基因组文文库的构建模式的构建模式图通通过对受体菌受体菌的培养的培养而而储存存基因基因17-2.2.基因文基因文库的构建方法的构建方法（1 1）鸟枪法法（2 2）反反转录法法（3 3）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 人人人人工工工工合合合合成成成成法法法法（真核生物真核生物真核生物真核生物）多用于原核生物多用于原核生物多用于原核生物多用于原核生物直接分离法直接分离法18-（1 1）鸟枪法：法：供体供体细胞中的胞中的DNADNA许多多DNADNA片段片段运运载体体限制限制酶与与载体体连接接受体受体细胞胞产生特定性状生特定性状导入入外源外源DNADNA扩增增目的基因目的基因分离分离(直接分离法直接分离法)19-以目的基因以目的基因转录成的成的信使信使RNA为模板，模板，再再反反转录酶的催化下反的催化下反转录成互成互补的的单链DNA，然后在，然后在DNA聚合聚合酶的作用下合成双的作用下合成双链DNA，即，即cDNA，从而，从而获得所需的基因。得所需的基因。（2 2）反反转录法法（cDNAcDNA文文库的构建方法的构建方法）20-（3）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：根据已知蛋白根据已知蛋白根据已知蛋白根据已知蛋白质质的氨基酸序列，的氨基酸序列，的氨基酸序列，的氨基酸序列，推推推推测测出相出相出相出相应应的信使的信使的信使的信使RNARNA序列，然后按序列，然后按序列，然后按序列，然后按照碱基互照碱基互照碱基互照碱基互补补配配配配对对原原原原则则，推，推，推，推测测出它的出它的出它的出它的结结构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序列，再通列，再通列，再通列，再通过过化学方化学方化学方化学方法，以法，以法，以法，以单单核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸为为原料合成目的基因。原料合成目的基因。原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列构基因的核苷酸序列推推推推测测推推推推测测目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成21-上述三种目的基因提取的方法有何上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？缺点？操作操作简便便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有分离出来的有时并并非一个基因非一个基因专一性一性强操作操作过程麻程麻烦，mRNAmRNA很不很不稳定，要定，要求的技求的技术条件条件较高高专一性最一性最强仅限于合成核苷酸限于合成核苷酸对较少的少的简单基因基因22-思考：思考：如何从基因文如何从基因文库中得到所需要的基因？中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；基因的基因的转录产物物mRNA；基因翻基因翻译产物蛋白物蛋白质等特性。等特性。注意：注意：u基因文基因文库中不是直接保管相中不是直接保管相应基因，基因，而是而是保存受体菌保存受体菌，菌中含基因。，菌中含基因。23-（二）利用（二）利用PCR技技术扩增目的基因增目的基因24-1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍25-模板DNA9526-PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物27-PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶28-PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始29-PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq30-PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束31-32-概念：概念：PCRPCR全称全称为_，是一，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技的核酸合成技术。前提条件：前提条件：_；原料：原料：_、_ _、_、_。原理：原理：_方式：以方式：以_方式方式扩增，即增，即_（n n为扩增循增循 环的次数）的次数）结果：果：聚合聚合酶链式反式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物热稳定定DNADNA聚合聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短使目的基因的片段在短时间内成百万倍地内成百万倍地扩增增模板模板DNADNA33-n 过程：程：变性、退火、延伸三步曲性、退火、延伸三步曲变性：性：加加热至至9095双双链DNADNA解解链成成为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至5560部分引物与模部分引物与模板的板的单链DNADNA的特定的特定互互补部位相配部位相配对和和结合合延伸：延伸：加加热至至7075以目的基因以目的基因为模板，合成互模板，合成互补的的新新DNADNA链变性性退火退火延伸延伸34-过程：程：a a、DNADNA变性（性（90-9590-95）：双）：双链DNADNA模板模板 在在热作用下，作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：系）：系统温度降低，引温度降低，引 物与物与DNADNA模板模板结合，形成局部合，形成局部_。c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互端延伸，合成与模板互补 的的_。氢键单链DNADNA双双链DNADNA链35-思考？思考？1 1个个DNADNA分子分子进行行PCRPCR扩增增,循循环4 4次，次，理理论上至少需要几个引物？上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循循环次数次数)（24-1）2=3036-n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐耐热DNA聚合聚合酶n dNTPsn Mg2+PCRPCR体系基本体系基本组成成分成成分一一对寡核苷酸序列：与目的基因寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互的起始段互补PCRPCR总结：37-PCR的基本反的基本反应步步骤变性性90-95C延伸延伸70-75C退火退火55-60CPCRPCR总结：38-Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2039-40-PCR技技术扩增与增与DNA复制的比复制的比较碱基互碱基互补配配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、模板、能量、酶DNADNA在高温下在高温下变性解旋性解旋解旋解旋酶催化催化体外复制体外复制细胞核内胞核内热稳定的定的DNADNA聚合聚合酶细胞内的胞内的DNADNA聚合聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子41-根据已知蛋白根据已知蛋白质的氨基酸序列，推的氨基酸序列，推测出相出相应的的mRNAmRNA序列，序列，然后按照碱基互然后按照碱基互补配配对原原则，推，推测出它的出它的结构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序列，再通列，再通过化学方法，化学方法，以以单核苷酸核苷酸为原料合原料合成目的基因成目的基因。蛋白蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列构基因的核苷酸序列推推测推推测目的基因目的基因化学合成化学合成（三）化学方法人工合成目的基因（三）化学方法人工合成目的基因43-人工合成人工合成(基因比基因比较小小)DNA合成合成仪44-q从基因文从基因文库中中获取取q利用利用PCRPCR技技术扩增增q利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法取目的基因的方法45-用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出粒，使其出现一个切一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其的基因，使其产生生_ _ _。将切下的目的基因片段插入将切下的目的基因片段插入质粒的粒的_处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重，形成了一个重组 DNADNA分子（重分子（重组质粒）粒）限制限制酶黏性末端黏性末端同一种限制同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接接酶1.1.过程程:二、构建二、构建表达表达载体体 核心核心46-质粒粒DNADNA分子分子限制限制酶处理理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因得目的基因DNADNA连接接酶重重组DNADNA分子（重分子（重组质粒）粒）同一种同一种过程程:47-2.2.基因表达基因表达载体的目的体的目的（1 1）使目的基因在受体）使目的基因在受体细胞中胞中稳定存在定存在并可以并可以遗传给下一代；下一代；（2 2）使目的基因能）使目的基因能够表达和表达和发挥作用。作用。48-科学家在培育抗虫棉科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失了多次失败，才才获得成功。得成功。起初把起初把苏云金芽云金芽孢杆菌的杆菌的抗虫基因抗虫基因插入插入载体体质粒中，然后粒中，然后导入棉花的受精卵中，入棉花的受精卵中，结果抗果抗虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的然后在插入抗虫基因的质粒中插入粒中插入启启动子子(抗虫基因首端抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，入棉花受精卵，长成的棉成的棉花植株花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的子、抗虫基因的质粒中插入粒中插入终止子止子(抗虫基因末抗虫基因末端端)，导入棉花受精卵，入棉花受精卵，结果成果成长的植株，有了的植株，有了抗虫能力。抗虫能力。资 料料:49-思考：思考：作作为基因工程表达基因工程表达载体，体，只需含有目的基因就可以完成任只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（什么？（P15P15）不可以。不可以。因因为目的基因在表达目的基因在表达载体中得到表达体中得到表达并并发挥作用，作用，还需要有其他控制元件需要有其他控制元件，如，如启启动子、子、终止子和止子和标记基因等。基因等。必必须构建上述元件的构建上述元件的主要理由主要理由是：是：50-（1 1）生物之生物之间进行基因交流，只有使用行基因交流，只有使用受体生物自受体生物自身基因身基因的启的启动子才能比子才能比较有利于基因的表达；有利于基因的表达；（2 2）通通过cDNAcDNA文文库获得的目的基因没有启得的目的基因没有启动子，只将子，只将编码序列序列导入受体生物中无法入受体生物中无法转录；（3 3）目的基因是否目的基因是否导入受体生物中需要有入受体生物中需要有筛选标记；（4 4）为了增了增强目的基因的表达水平，往往目的基因的表达水平，往往还要增加一要增加一些其他些其他调控元件，如增控元件，如增强子子（增增强基因启基因启动子工作效率子工作效率的的顺式作用序列，能式作用序列，能够在相在相对于启于启动子的任何方向和任子的任何方向和任何位置何位置(上游或下游上游或下游)上都上都发挥作用。作用。）等；等；（5 5）有有时需要确定目的基因表达的需要确定目的基因表达的产物存在于物存在于细胞的胞的什么部位，往往要加上可以什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做存在部位的基因（或做成目的基因与成目的基因与标识基因的融合基因），如基因的融合基因），如绿色色荧光蛋白光蛋白基因等。基因等。51-3.3.基因表达基因表达载体的体的组成：成：它它们有什么作用？有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启、启动子子c、终止子止子d、标记基因基因52-调节基基 因因操操纵基基 因因结构基因构基因RNA聚合聚合酶半乳糖苷半乳糖苷酶 酶酶 RNA聚合聚合酶启启动子子RNA聚合聚合酶启启动子子：位于基因首端的一段特殊的位于基因首端的一段特殊的DNA片断，片断，它是它是RNA聚合聚合酶识别和和结合的部位，有了它才能合的部位，有了它才能驱动基因基因转录出出mRNA，最，最终获得蛋白得蛋白质。53-思考思考1：表达表达载体体为什么一定要有启什么一定要有启动子？子？n（1 1）生物之）生物之间进行基因交流，只有使行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启用受体生物自身基因的启动子才能有子才能有利于基因的表达；利于基因的表达；n（2 2）通）通过cDNAcDNA文文库获得的目的基因没得的目的基因没有启有启动子，只将子，只将编码序列序列导入受体入受体细胞无法胞无法转录。54-思考思考2：终止子的作用是什么？止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊止子是位于基因尾端的一段特殊的的DNA片断，能片断，能终止止mRNA的的转录。是是为了了鉴别受体受体细胞中是否含有目胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的的基因，从而将有目的基因的细胞胞筛选出来。出来。思考思考3：标记基因有什么作用？基因有什么作用？55-载体体与与表达表达载体体的区的区别：二者都有：二者都有标记基因和基因和复制原点两部分复制原点两部分DNADNA片段。表达片段。表达载体在体在载体基体基础上上增加了目的基因、启增加了目的基因、启动子、子、终止子三部分止子三部分结构。构。注意注意用到的工具用到的工具酶：既用到限制既用到限制酶切割切割载体，又用到体，又用到DNADNA连接接酶将目的基因和将目的基因和载体拼接，两种体拼接，两种酶作用的作用的化学化学键都是磷酸二都是磷酸二酯键。启启动子、子、终止子止子对于目的基因表达必不可少。于目的基因表达必不可少。目的基因不能目的基因不能单独独进入受体入受体细胞，胞，必需以表达必需以表达载体的方式携体的方式携带进去。去。56-基基因因工工程程技技术路路线57-三、将目的基因三、将目的基因导入受体入受体细胞胞常用的受体常用的受体细胞：胞：有大有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、杆菌、酵母菌和酵母菌和动植物植物细胞等。胞等。将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞的原理：胞的原理：借借鉴细菌或病毒侵染菌或病毒侵染细胞胞的途径。的途径。（一）（一）转化：化：目的基因目的基因进入入_内，并且在内，并且在 受体受体细胞内胞内维持持_和和_的的过程程受体受体细胞胞稳定定表达表达58-（二）（二）方法方法将目的基因将目的基因导入入植物植物细胞胞将目的基因将目的基因导入入动物物细胞胞将目的基因将目的基因导入入微生物微生物细胞胞农杆菌杆菌转化法化法基因基因枪法法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法微注射法感受感受态细胞胞59-1.1.将目的基因将目的基因导入植物入植物细胞胞n农杆菌杆菌转化法化法n基因基因枪法法n花粉管通道法花粉管通道法60-（1 1）农杆菌杆菌转化法化法特点：特点：易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，子植物，对大多数大多数单子叶植子叶植物没有感染能力物没有感染能力原理：原理：TiTi质粒上的粒上的T-DNAT-DNA可以可以转移到受体移到受体细胞，胞，并整合到受体并整合到受体细胞染色体的胞染色体的DNADNA上。上。61-转化化过程程:TiTi质粒粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体体导入入植植物物细胞胞插入插入植物植物细胞胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入入农杆杆菌菌62-基因基因枪法又称微法又称微弹轰击法，是法，是利用利用压缩气体气体产生的生的动力力，将包裹在金属将包裹在金属颗粒表粒表面的表达面的表达载体体DNADNA打打入受体入受体细胞中胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因）基因枪法法适用于适用于适用于适用于单单子叶植物子叶植物子叶植物子叶植物63-（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱植物花粉在柱头上萌上萌发后，花粉管要后，花粉管要穿穿过花柱直通胚囊。花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管成的花粉管还未愈合未愈合前，剪去柱前，剪去柱头，然后，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基因）（含目的基因），使目的基因借助花，使目的基因借助花粉管通道粉管通道进入受体入受体细胞。胞。适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物64-胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊65-2.2.将目的基因将目的基因导入入动物物细胞胞（1 1）方法：）方法：显微注射法微注射法（将基因表达（将基因表达载体提体提纯，用，用显微微仪注射到注射到受精卵受精卵中）中）66-（2 2）操作程序）操作程序:提提纯含目的基因表达含目的基因表达载体体取受精卵取受精卵显微注射微注射移植到子移植到子宫受精卵受精卵发育育新性状新性状动物物67-常用法常用法：CaCa2+2+处理理常用菌常用菌：大：大肠杆菌杆菌微生物作受体微生物作受体细胞原因：胞原因：繁殖快、多繁殖快、多为单细胞、胞、遗传物物质相相对少少过程：程：CaCa2+2+处理大理大肠杆菌杆菌感受感受态细胞胞表达表达载体体与感受与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因将目的基因导入微生物入微生物细胞胞思考：思考：为什么要用什么要用Ca2+处理受体理受体细胞？胞？用用CaCa2 2处理，增加理，增加细菌菌细胞壁的通透性胞壁的通透性68-受精卵受精卵体体细胞胞受精卵受精卵细胞胞/个体个体农杆菌杆菌转化法化法基因基因枪法法花粉管通道法花粉管通道法显微注微注射技射技术用用CaCa2+2+处理成理成感受感受态细胞胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确入目的基因的作法正确的是（）的是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射到受精卵中B.B.将将编码毒素蛋白的毒素蛋白的DNADNA序列，与序列，与质粒重粒重组，导入入细菌，用菌，用该细菌感染棉的体菌感染棉的体细胞，再胞，再进行行组织培养培养C.C.将将编码毒素蛋白的毒素蛋白的DNADNA序列，与序列，与质粒重粒重组，注射到棉的子房并，注射到棉的子房并进入受精卵入受精卵D.D.将将编码毒素蛋白的毒素蛋白的DNADNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中69-四、目的基因的四、目的基因的检测与与鉴定定n检测:q是否插入目的基因是否插入目的基因q是否是否转录q是否翻是否翻译n鉴定定:q分子水平分子水平鉴定定q个体生物学水平个体生物学水平鉴定定70-1 1、检测转基因生物染色体的基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出首先取出转基因生物的基因基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法）方法:DNADNA分子分子杂交交（2 2）过程程:将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作作标记,以此做以此做探探针；使探使探针和和转基因生物的基因基因生物的基因组杂交交,若若显示示出出杂交交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）（一）检测71-基因探基因探针：是一段是一段是一段是一段带带有有有有检测标记检测标记，且序列已知的，且序列已知的，且序列已知的，且序列已知的，与目的基因互与目的基因互与目的基因互与目的基因互补补的核酸序列。的核酸序列。的核酸序列。的核酸序列。基因探基因探基因探基因探针针通通通通过过分子分子分子分子杂杂交与目的基因交与目的基因交与目的基因交与目的基因结结合，合，合，合，产产生生生生杂杂交信号，能从浩翰的基因交信号，能从浩翰的基因交信号，能从浩翰的基因交信号，能从浩翰的基因组组中把目的基因中把目的基因中把目的基因中把目的基因显显示出来。示出来。示出来。示出来。72-DNADNA分子分子杂交示意交示意图 采用一定的技采用一定的技术手段，将两种生物的手段，将两种生物的DNADNA分分子的子的单链放在一起，如果放在一起，如果这两个两个单链具有互具有互补的碱基序列，那么，互的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会的碱基序列就会结合合在一起，形成在一起，形成杂合双合双链区；在没有互区；在没有互补碱基序碱基序列的部位，仍然是两条游离的列的部位，仍然是两条游离的单链。73-（二）（二）鉴定（个体生物学水平）定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否目的基因是否转录出了出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻目的基因是否翻译成蛋白成蛋白质抗虫抗虫鉴定、抗病定、抗病鉴定、活性定、活性鉴定等定等方法方法:分分 子子 杂 交交方法方法:抗原抗原-抗体抗体杂交交过程程:用上述探用上述探针和和转基因生物的基因生物的mRNAmRNA杂交交,若出若出现杂交交带,表明目的基因表明目的基因转录出了出了mRNAmRNA。74-提提取取（3）检测目的基因是否翻目的基因是否翻译成蛋白成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体抗体杂交交苏云金杆菌云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白蛋白质 出出现杂交交带脱脱分分化化组织培培养养75-若不能表达，若不能表达，要要对抗虫基因抗虫基因再再进行行修修饰。怎怎样检验抗虫基因在棉抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？胞内是否表达呢？没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉棉铃虫虫虫没有死虫没有死虫被虫被杀死死没有表达没有表达目的基目的基因表达因表达76-v目的基因的表达和检测77-提示：提示：DNADNA分子分子杂交技交技术首先提取受体首先提取受体细胞中的胞中的DNADNA，然后高温解成，然后高温解成单链，再与，再与同位素同位素标记的的DNADNA探探针杂交；交；抗原抗体抗原抗体杂交所用到的抗体是交所用到的抗体是用表达出的蛋白用表达出的蛋白质注射注射动物物进行免疫，行免疫，产生相生相应的抗体，并提取出而来的。的抗体，并提取出而来的。78-79-归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因取目的基因u从基因文从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达构建基因表达载体体u目的基因、启目的基因、启动子、子、终止子、止子、标记基因基因3.将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞胞u转化法（微生物）、化法（微生物）、农杆菌杆菌转化法（植物）、化法（植物）、显微注射法微注射法（动物）物）4.目的基因的目的基因的检测与与鉴定定u检测：是否插入、：是否插入、转录、翻、翻译80-为什么要构建基因文什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的？直接从含有目的基因的生物体内提取不行生物体内提取不行吗？构建基因文构建基因文库是是获取目的基因的方法之一，并不是取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通以通过PCRPCR方式从含有方式从含有该基因的生物的基因的生物的DNADNA中，直接中，直接获得，也可以通得，也可以通过反反转录，用，用PCRPCR方式从方式从mRNAmRNA中中获得，不得，不一定要构建基因文一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得得许多基因，或者想知道多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之种生物与另一种生物之间有有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不育的不同同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因的全基因组序列，往往就需要构建基因文序列，往往就需要构建基因文库。81-利用大利用大肠杆菌可以生杆菌可以生产出人的胰出人的胰岛素，素，联系前面系前面有关有关细胞器功能的知胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以人的糖蛋白，可以用大用大肠杆菌杆菌吗？有些蛋白有些蛋白质肽链上有共价上有共价结合的糖合的糖链，这些些糖糖链是在内是在内质网和高网和高尔基复合体上加工完成基复合体上加工完成的，内的，内质网和高网和高尔基复合体存在于真核基复合体存在于真核细胞胞中，大中，大肠杆菌不存在杆菌不存在这两种两种细胞器，因此，胞器，因此，在大在大肠杆菌中生杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。种糖蛋白是不可能的。寻根根问底：底：82-根据根据农杆菌可将目的基因杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机入双子叶植物的机理理,你能分析出你能分析出农杆菌不能将目的基因不能杆菌不能将目的基因不能导入入单子叶植物的原因子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因若将一个抗病基因导入小麦中入小麦中,理理论上上讲你你应该怎怎样做做?要要选择合适的合适的农杆菌菌株，因杆菌菌株，因为不是所有的不是所有的农杆菌杆菌菌株都可以侵染菌株都可以侵染单子叶植物；子叶植物；要加要加趋化和化和诱导的物的物质，目的是使，目的是使农杆菌向植物杆菌向植物组织的受的受伤部位靠部位靠拢（趋化性）和激活化性）和激活农杆菌的杆菌的诱导的的基因，使基因，使T-DNAT-DNA转移并插入到染色体移并插入到染色体DNADNA上。上。酚酚类诱导物主要在双子叶植物物主要在双子叶植物细胞壁中合胞壁中合成，通常不存在于成，通常不存在于单子叶植物中子叶植物中 83-4.-4.-珠蛋白是珠蛋白是动物血物血红蛋白的重要蛋白的重要组成成分。当它的成分异成成分。当它的成分异常常时，动物有可能患某种疾病，如物有可能患某种疾病，如镰刀形刀形细胞胞贫血症。假如血症。假如让你用基因工程的方法，使大你用基因工程的方法，使大肠杆菌生杆菌生产出鼠的出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，想一想，应如何如何进行行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的珠蛋白基因的编码序列（序列（cDNA)cDNA)。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大前接上在大肠杆菌中可以适用的启杆菌中可以适用的启动子，另外子，另外加上抗四加上抗四环素的基因，构建成一个表达素的基因，构建成一个表达载体。体。（3 3）将表达）将表达载体体导入无四入无四环素抗性的大素抗性的大肠杆菌中，然后在杆菌中，然后在含有四含有四环素的培养基上培养大素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达杆菌。如果表达载体未体未进入入大大肠杆菌中，大杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果素基因而死掉；如果培养基上培养基上长出大出大肠杆菌菌落，杆菌菌落，则表明表明-珠蛋白基因已珠蛋白基因已进入入其中。其中。（4 4）培养）培养进入了入了-珠蛋白基因的大珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破杆菌，收集菌体，破碎后从中提取碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。84-