半抗原免疫分析(全面).ppt

半抗原免疫分析半抗原免疫分析ABCABC1.内容内容l一、基本概念一、基本概念l抗原抗原l抗体抗体l二、免疫分析方法二、免疫分析方法l分分类lELISAELISA原理与方法原理与方法l方法建立方法建立-苏丹丹红为例例2.抗原抗原 antigen,Agantigen,Ag3.(一一)抗原的概念抗原的概念 抗原抗原(Antigen,Ag(Antigen,Ag)是一是一类能能刺激刺激机体免疫系机体免疫系统产生特异性免疫生特异性免疫应答答,并能与相并能与相应的免疫的免疫应答答产物在体内或体外物在体内或体外发生生特异性特异性结合合的物的物质.4.(二二)完全抗原与半抗原完全抗原与半抗原1.1.完全抗原（完全抗原（complex antigen):complex antigen):既具免疫原性又有免疫反既具免疫原性又有免疫反应性的物性的物质.如如:大多数蛋白大多数蛋白质.2.2.半抗原半抗原(hapten):(hapten):仅有免疫反有免疫反应性而无免疫原性的物性而无免疫原性的物质.如如:大多数多糖、大多数多糖、类脂、某些脂、某些药物物.半抗原半抗原+载体体(蛋白蛋白质)完全抗原完全抗原5.6.共同抗原与交叉反应7.共同抗原与交叉反共同抗原与交叉反应 1.1.共同抗原共同抗原(Common antigens)Common antigens)：存在于两种不同的抗原之存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗的相同或相似的抗原决定簇，称原决定簇，称为共同抗原。共同抗原。2.2.交叉反交叉反应(Cross-reaction)Cross-reaction)：由于存在共同抗原造成抗体由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似具有相同或相似决定簇的不同抗原决定簇的不同抗原发生反生反应，此称，此称为交叉反交叉反应。检测意意意意义义：假阳性（避免）：假阳性（避免）：假阳性（避免）：假阳性（避免）多残留多残留多残留多残留检测检测（利用）（利用）（利用）（利用）8.9.农药、兽药、生物毒素、重金属、生物毒素、重金属、维生素、防生素、防腐腐剂、植物激素等半抗原、植物激素等半抗原 在食品安全、植物学、在食品安全、植物学、环境境检测等等领域，主要是半抗原域，主要是半抗原类物物质。10.抗体抗体 antibody,Ab抗原与抗体是天生的一抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了也离不了谁；两者既是好朋友，又是一两者既是好朋友，又是一对冤家。冤家。11.一、基本概念一、基本概念 1.1.抗体（抗体（AntibodyAntibody，AbAb）指指B B淋巴淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成化成为浆细胞，胞，产生的能与相生的能与相应抗原抗原发生特异生特异性性结合的免疫球蛋白。合的免疫球蛋白。存在形式：存在形式：膜型膜型（membrane immunoglobulin,mIgmembrane immunoglobulin,mIg）B B细细胞膜上的抗原受体胞膜上的抗原受体；分泌型分泌型(secreted immunoglobulin,sIgsecreted immunoglobulin,sIg)分泌分泌进进入体液入体液,介介导体液免疫体液免疫应答。答。12.二、免疫球蛋白的分子二、免疫球蛋白的分子结构构（一）免疫球蛋白的基本（一）免疫球蛋白的基本结构：构：由四条多由四条多肽链组成，呈成，呈“Y”Y”或或“T”T”型型 1.1.组成：成：l 2 2条条长链，又称重，又称重链（Heavy chainHeavy chain，H H链）：）：含含450-550aa450-550aa，分子量，分子量为55-75KD55-75KD。l 2 2条短条短链，又称，又称轻链（Light chainLight chain，L L链）：）：含含214aa214aa，分子量，分子量为25KD25KD。13.14.15.l2.2.分分类、分型：、分型：（1 1）根据重）根据重链氨基酸氨基酸组成、序列及成、序列及结构的差异，将构的差异，将Ig Ig 分分为五五类：IgM(IgM(IgM(IgM()、IgG(IgG(IgG(IgG()、IgA(IgA(IgA(IgA()、IgD(IgD(IgD(IgD()、IgE(IgE(IgE(IgE()l l 亚类亚类：IgGIgGIgGIgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgAIgAIgAIgA：IgA1,IgA2IgA1,IgA2IgA1,IgA2IgA1,IgA2 IgMIgMIgMIgM:IgM1,IgM2:IgM1,IgM2:IgM1,IgM2:IgM1,IgM2（2 2 2 2）分两型：）分两型：）分两型：）分两型：根据根据根据根据轻链轻链氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸组组成、序列及成、序列及成、序列及成、序列及结结构的差异，可将构的差异，可将构的差异，可将构的差异，可将轻轻 链链分分分分为为两型：两型：两型：两型：和和和和型型型型 l l 每一每一每一每一IgIgIgIg单单体分子两条重体分子两条重体分子两条重体分子两条重链链必必必必须须同同同同类类，两条，两条，两条，两条轻链轻链必必必必须须l l 同型。同型。同型。同型。16.抗体的制抗体的制备方法方法18.19.l3.3.基因工程抗体基因工程抗体(GeAb):(GeAb):第三代抗体第三代抗体 由基因重由基因重组技技术制制备的抗体的抗体,称称为基因工程抗基因工程抗体。体。l 嵌合抗体嵌合抗体(chimeric Ab)l 人源抗体（人源抗体（humanized Ab)l 双特异性抗体（双特异性抗体（bispecific Ab)l Fab/ScFV（single chain FV fragment)单域抗体（域抗体（single chain Ab)20.抗体的抗体的结构与功能的关系，构与功能的关系，所展所展现出的生物学功能是其出的生物学功能是其结构的构的完美表演者。完美表演者。21.免疫分析技免疫分析技术内内 容容l分析方法分分析方法分类l几种常用免疫分析技几种常用免疫分析技术lELISAELISAl侧流免疫流免疫层析析l分析方法的建立分析方法的建立l分析数据的分析数据的拟合合22.常用的免疫常用的免疫标记物物质类别 标记物物 用途用途荧光素光素 FITC、RB200、TRITC 免疫免疫组化化 镧系元素螯合物系元素螯合物 免疫分析免疫分析测定定放射性核素放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析免疫分析测定定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫免疫组化化 免疫分析免疫分析测定定化学化学发光物光物 Luminol、lucigenin 免疫分析免疫分析测定定金属金属颗粒粒 胶体金、胶体金、铁蛋白蛋白 免疫免疫组化化 免疫分析免疫分析测定定 23.一、一、标记免疫方法分免疫方法分类1 1按按标记物的种物的种类分分(1)(1)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay(radioimmunoassay，RIA)RIA)(2)(2)酶免疫分析免疫分析(enzyme immunoassay(enzyme immunoassay，EIA)EIA)(3)(3)(3)(3)化学化学化学化学发发光光光光酶酶免疫分析免疫分析免疫分析免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)CIZIA)CIZIA)CIZIA)(4)(4)(4)(4)荧荧光免疫分析法光免疫分析法光免疫分析法光免疫分析法(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay，FIA)FIA)FIA)FIA)。5/7/202424.2 2按是否加入分离按是否加入分离剂分分(1)均相免疫分析均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中，当抗原一抗体反在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反达到平衡后，反应液中液中结合的合的标记药物与游离的物与游离的标记药物之中有一种不物之中有一种不产生信号或信号生信号或信号消失，因此无需将反消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中液分作两相，即可在均相溶液中进行行测定，定，故称故称为均相免疫分析。如均相免疫分析。如酶放大免疫放大免疫测定技定技术(enzyme(enzyme multiplied immunoassay techniquemultiplied immunoassay technique，EMIT)EMIT)。(2)非均相免疫分析非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中，当抗原一抗体反在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在反达到平衡后，只有在反应液中加入分离液中加入分离剂，将游离，将游离标记药物和物和结合合标记药物分开之后，物分开之后，才能才能测出各自部分的出各自部分的标记药物物浓度。否度。否则，测定的是两者的定的是两者的总浓度。由于度。由于这种信号的种信号的测定需将反定需将反应液分成液液分成液-固两相后，才能分固两相后，才能分别测定，故称定，故称为非均相免疫分析。如非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme linked ELISA(Enzyme linked immunosorbent immunoassay)immunosorbent immunoassay)5/7/202425.ELISAELISA简介介26.（一）（一）ELISA技技术的原理的原理间接法接法 夹心法心法 竞争法争法27.28.夹心法心法Sandwich29.竞争法争法30.（二）（二）ELISA所用所用试剂试剂材料材料l1、固相l2、酶l3、底物l4、缓冲液l5、仪器31.1、固定相、固定相聚次亚乙烯32.2、最常用的、最常用的标记酶1 1辣根辣根过氧化物氧化物酶(HRP):(HRP):约有有5050的的EIAEIA使用此使用此酶。2 2碱性磷酸碱性磷酸酯酶(AP):AP(AP):AP标记的的结合物性合物性质稳定，其活定，其活性可用分光光度性可用分光光度计或或荧光光计测量。量。3 36-6-磷酸葡萄糖脱磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD):(G-6-PD):通常用于均相通常用于均相EIAEIA。4 4-半乳糖苷半乳糖苷酶(-Gal):(-Gal):适用于均相适用于均相EIAEIA和非均相和非均相EIAEIA。5 5苹果酸脱苹果酸脱氢酶(MDH):(MDH):多用于尿多用于尿样的均相的均相EIAEIA。5/7/202433.3、最常用的底物、最常用的底物l邻苯二酚(OPC)l四甲基联苯胺(TMB)34.4、缓缓冲液冲液lPBS(T)lTris-HCllNa3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂35.酶标仪4、仪仪器器36.酶标仪37.（三）（三）免疫分析方法建立免疫分析方法建立苏丹丹红为例例38.Step 1:Hapten and conjugate39.Step 2:characterization of conjugate40.Step 3chessboard tiatrion and calibration curve41.Step 4:optimizationnonessential 42.例例1、标记标记抗原抗原浓浓度度对检测对检测的影响的影响43.例，例，pH影响影响44.Step 5:sample analysis45.Step 6:validation46.一个一个难点：基点：基质效效应47.基基质质效效应应l基基质：样品中除了目品中除了目标分析物外分析物外还含有其他的含有其他的物物质，这些物些物质可能会可能会对检测结果造成干果造成干扰，这些干些干扰成分称成分称为基基质，其干，其干扰称称为基基质效效应(matrix effect)(matrix effect)l（1 1）基）基质来源来源l水、土壤的腐殖水、土壤的腐殖质l食品中的蛋白、脂肪等食品中的蛋白、脂肪等l溶液中作溶液中作为促溶的有机溶促溶的有机溶剂等等48.例例1：环境水境水样的基的基质效效应49.（2）基）基质质干干扰扰的消除的消除l掩蔽掩蔽剂（缓冲液冲液调整）整）l样品稀品稀释l样品前品前处理：理：净化化50.