脯氨酸含量的测定.docx

脯氨酸含量得测定
在逆境条件下,植物体内脯氨酸(proline,Pro)得含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物得抗逆性,抗旱性强得品种往往积累较多得脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种得生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内得代谢过程,因而能降低凝固点,有防止细胞脱水得作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸含量增加,可提高植物得抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种得生理指标。
一、原理
当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸得溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即为红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素得深浅即表示脯氨酸含量得高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸得含量。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
待测植物叶片
(二)仪器设备
1、 722型分光光度计;
2、研钵;
3、100ml小烧杯;
4、容量瓶;
5、大试管;
6、普通试管;
7、移液管;
8、注射器;
9、水浴锅;
10、漏斗;
11、漏斗架;
12、滤纸;
13、剪刀。
(三)试剂
1、酸性茚三酮溶液:将1、25g茚三酮溶于30ml冰醋酸与20ml 6mol/l 磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中。
2、 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
3、冰醋酸。
4、甲苯。
三、实验步骤
1、标准曲线得绘制
(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯中内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。
(2)系列脯氨酸浓度得配置:取6个50ml容量瓶,分别加入脯氨酸原液0、5ml、1、0ml、1、5ml、2、0ml、2、5ml及3、0ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶得脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。
(3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度得脯氨酸溶液及2ml冰醋酸与2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。
(4)冷却后各试管准确加入4ml甲苯,振荡30s,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。
(6)标准曲线得绘制:先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变得回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸得含量(ug/2ml)。
2、样品得测定
(1)脯氨酸得提取:准确称取不同处理得待测植物叶片各0、5g,分别置大管中,然后向各管分别加入3%得磺基水杨酸溶液5ml,在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净得试管中,滤液即为脯氨酸得提取液。
(2)吸取2ml提取液于另一干净得带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。
(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30s,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000r/min下离心5min。
(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。
四、结果计算
根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸得含量(X,ug/2ml),然后计算样品中脯氨酸含量得百分数。计算公式如下:
单位鲜质量样品得脯氨酸含量(%)=X×VtW×Vs×106 x100
式中:X为从标准曲线查出得2ml测定液中脯氨酸得含量(ug/2ml);
Vt为提取液体积(ml);
Vs为测定时取用得样品体积(ml);
W为样品质量(g)。
植物体内硝酸还原酶活力得测定
硝酸还原酶(NR),就是植物氮素同化得关键酶,它催化植物体内得硝酸盐还原为亚硝酸盐,(NO3-＋NADH＋H+NRNO2-＋NAD+＋H2O)。产生得亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)α-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成得红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生得亚硝态氮得量表示。一般以ug氮/(g·h)为单位。NR得测定可分为活体法与离体法。活体法操作简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性好。
离体法
一、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
水稻、小麦叶片、幼穗等。
(二)仪器设备
1、冷冻离心机
2、分光光度计
3、天平(感量0、1mg)
4、冰箱
5、恒温水浴
6、研钵
7、剪刀
8、离心管
9、具塞试管
10、移液管
11、吸尔球。
(三)试剂
1、亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO2 0、9857g溶于去离子水后定容至1000ml,然后再吸取5ml定容至1000ml,即为含亚硝态氮1ug/ml得标准液。
2、 0、1mol/l pH7、5得磷酸缓冲液:30、0905g Na2HPO4·12 H2O与2、4965g NaH2PO4·2 H2O加去离子水溶解后定容至1000ml。
3、 1%(质量浓度)磺胺溶液:1、0g磺胺溶于100ml 3mol/l盐酸中(25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/l HCl)。
4、 0、02%(质量浓度)萘基乙烯胺溶液:0、0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中,贮于棕色瓶内。
5、 0、1mol/l KNO3溶液:2、5275g KNO3溶于250ml 0、1mol/l pH7、5得磷酸缓冲液。
6、 0、025mol/l pH8、7得磷酸缓冲液:8、8640g Na2HPO4·12 H2O,0、0570g K2HPO4·3H2O溶于1000ml去离子水中。
7、提取缓冲液:0、1211g半胱氨酸,0、0372g EDTA溶于100ml 0、025mol/l pH8、7得磷酸缓冲液中。
8、 2mg/ml NADH溶液:2mg NADH溶于1ml 0、1mol/l pH7、5得磷酸缓冲液中(临用前配制)。
二、实验步骤
(一)标准曲线制作
取7支洁净烘干得15ml刻度试管按下表顺序加入试剂,配成0~2、0ug得系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min,然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(ug)为横坐标(X),吸光度值为纵坐标(Y)建立回归方程。
配置标准溶液时各物质加入量
试剂/ml 管 号
1 2 3 4 5 6 7
亚硝酸钠标准液 0 0、2 0、4 0、8 1、2 1、6 2、0
蒸馏水 2、0 1、8 1、6 1、2 0、8 0、4 0
1%磺胺 4 4 4 4 4 4 4
0、02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4
每管含亚硝态氮/ug 0 0、2 0、4 0、8 1、2 1、6 2、0
(二)样品中硝酸还原酶活力测定
1、酶得提取:称取0、5g鲜样,剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min,取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液,研磨匀浆,转入离心管在4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液。
2、酶得反应:取粗酶液0、4ml于10ml试管中,加入1、2ml 0、1mol/l KNO3磷酸缓冲液与0、4ml NADH溶液,混匀,在25℃水浴中保温30min,对照不加NADH溶液,而以0、4ml 0、1mol/l pH7、5得磷酸缓冲液代替。
3、终止反应与比色测定:保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应,再加1ml萘基乙烯胺溶液,显色15min后于4000r/min下离心15min,取上清液在540nm下比色测定。根据回归方程计算出反应液中所产生得亚硝态氮总量(ug)。
三、结果计算
样品中硝酸还原酶活性［ug/(g▪h)］＝xVs×VTW×t
其中:x为反应液酶催化产生得亚硝态氮总量(ug);
VT为提取酶时加入得缓冲液体积(ml);
Vs为酶反应时取用得粗酶液体积(ml);
W为样品鲜质量(g);
t 为反应时间(h)。
根系活力得测定(TTC法)
植物根系就是活跃得吸收器官与合成器官,根得生长情况与活力水平直接影响地上部分得生长、营养状况及产量水平。
一、原理
氯化三苯基四氮唑(TTC)就是标准氧化还原电位为80mV得氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水得三苯甲腙。
生成得三苯甲腙比较稳定,不会被空气中得氧自动氧化,所以TTC被广泛地用作酶试验得氢受体,植物根系中脱氢酶所引起得TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二醛、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力得指标。
二、材料、设备仪器及试剂
(一)材料
水培或沙培小麦、玉米等植物根系。
(二)仪器设备
1、分光光度计
2、分析天平(感量0、1mg)
3、电子顶载天平(感量0、1g)
4、温箱
5、研钵
6、50ml三角瓶
7、漏斗
8、100ml量筒
9、10ml吸量管
10、10ml刻度试管
11、试管架
12、10ml容量瓶
13、药勺
14、石英砂适量
15、10ml、1000ml烧杯。
(三)试剂
1、乙酸乙酯(分析纯)
2、次硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉末。
3、 1%TTC溶液:准确称取TTC1、0g,溶于少量水中,定容至100ml。用时稀释至所需要得各种浓度。
4、磷酸缓冲液(1/15mol/l pH7):准确称取9、067g磷酸二氢钾(KH2PO4),加1mol/l NaOH溶液38、8ml,并加水定容至1000ml(或者1/15mol/l得磷酸氢二钠:称取Na2HPO4·12 H2O 23、88g蒸馏水定容至1000ml;1/15mol/l得磷酸二氢钾:称取分析纯KH2PO4 9、07g,用纯水定容至1000ml。pH7得磷酸缓冲液即为取1/15mol/l得磷酸氢二钠12ml,1/15mol/l得磷酸二氢钾8ml,两者混合即可。)
5、 1mol/l硫酸:用量筒取相对质量1、84得浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水得烧杯中,冷却后稀释至1000ml。
三、实验步骤
定量测定
(1)TTC标准曲线得制作:取0、4%TTC溶液0、25ml放入10ml试管中,加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色得甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取此液0、25ml、0、50ml、1、00ml、1、50ml、2、00ml置于10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug得标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。
(2)称取根尖样品0、2~0、3g,放入10ml烧杯中,加入0、4%TTC溶液与磷酸缓冲液各5ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比,测出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
单位质量鲜根得四氮唑还原强度［mg/(g ▪h)］＝CW×t
式中:C为从标准曲线查出得四氮唑还原量(mg);
W为样品重量(g);
t 为反应时间(h)。