抗氧化活性研究方法.ppt

抗氧化活性研究方法以酶标法清除DPPHDPPH自由基为主1.目录v一.检测抗氧化活性的原因v二.自由基的产生及抗氧化的重要性v三.检测方法v四.DPPH.DPPH法（原理，一般方法，酶标法）v五.ABTS.ABTS法 v六.TBARS.TBARS法v七.铁离子还原能力(FRAP)(FRAP)2一.检测抗氧化活性的原因 1.1.天然植物中许多化学物质具有抗氧化活性2.2.抗氧化剂有延缓衰老等功效，越来越受到人们关注3.3.据文献记齐墩果酸型三萜有较好的抗氧化活性4.4.抗氧化活性测试简单，快捷，经济3 二.自由基的产生及抗氧化的重要性抗氧化剂自由基对人体造成的伤害天然植物4三.检测方法v目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理：v(1)(1)在特定条件下，样品对检测体系中脂类物质的氧化抑制能力反映被测物的抗氧化活性；（TBARSTBARS法）v(2)(2)在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力反映被测物的抗氧化活性；（DPPHDPPH自由基的清除）v(3)(3)在特定条件下，测定样品的还原能力反映被测物的抗氧化活性。（还原FeFe3+3+）5四.DPPH法 1.1.原理 DPPH(DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种以氮为中心的稳定自由基。特点：醇溶液呈紫色，波长为517nm517nm下具有最大吸收。具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，有自由基清除剂存在时，DPPHDPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。6实验步骤 2.2.实验步骤 （1 1）酶标法检测酶标仪v取9696孔细胞培养板，各孔分别加入150150molLmolL-1-1的DPPHDPPH溶液180L180L,各浓度梯度样品溶液2 20 0LL,终浓度分别为3 3.9 9 5 50000molLmolL-1-1，反应总体积200L200L,以溶剂作对照。加样后，振荡混匀。封板胶封板后，室温下避光静置。分别在1010 120min120min时间范围内于517nm517nm处测定各孔吸光度值。观察样品抗DPDPP PH H的时效量效变化过程，确定实验的稳定性和最佳实验反应时间。v计算公式为:清除率()=A)=A(溶剂)-A-A(样品)/A/A（溶剂）x x100100 7VitEVitE清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲线1 10 0-120m120mi in n内,随着作用时间的延长VitEVitE抗DPPHDPPH作用增强，但在3 3.9 9-3131.2molL2molL-1-1范围内，各时间点的药效变化不明显，6262.5 5-500molL500molL-1 1浓度范围，随着浓度增加，各时间点的药物作用曲线逐渐分离，并在500500molLmolL-1 1，各时间点量效趋于平稳。从图中可以看出，在这些时间点中，30min30min的量效曲线基本呈斜线上升。30min30min8VitEVitE清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲线 反应时间t t为30min30min的量效曲线（相关系数）9实验步骤 （2 2）一般方法紫外分光光度计法 将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL0.1mL样品加入3.5 3.5 mL DPPHmL DPPH甲醇溶液(0.06 mmol/L)(0.06 mmol/L)，混合30min30min后测定515 515 nmnm处吸光度。每份样品平行操作3 3次。计算公式为:清除率()=A)=A(溶剂)-A-A(样品)/A/A（溶剂）x x10010010酶标法优势 3.3.酶标法优势 抗氧化微孔板实验方法的优势：耗材量少，试剂量以微升计；试剂种类少，部分试剂配制可交互使用；方法简便，耗时短；可重复性强，可以广泛应用于药物筛选，特别是高通量药物筛选研究。11五.ABTS法 1.1.原理 以水溶性的ABTSABTS+自由基引发剂为显色剂。特点：ABTSABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝/绿色阳离子自由基ABTSABTS+，最大吸光波长为734nm734nm。向ABTSABTS+其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+ABTS+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTSABTS+这种自由基的734nm734nm吸光波长下检测吸光度的变化来反映物质的抗氧化能力。12实验步骤 2.2.实验步骤v将样品用甲醇配制成一系列浓度,取0 0.15mL15mL样品加入2 2.85mLABTS85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min10min后,在734nm734nm处测定吸光度。每份样品平行操作3 3次。v计算公式为：清除率()=A)=A(溶剂)-A-A(样品)/A/A（溶剂）100100 vA A（溶剂）为2 2.85 mLABTS85 mLABTS溶液与0 0.15mL15mL甲醇混合后的吸度，A A（样品）为2 2.85mLABTS85mLABTS溶液与0 0.15mL15mL样品混合后的吸光度。13ABTS法优缺点 3.3.优缺点 简便，快速，适合于大量样品的检测。ABTSABTS在与氢原子供体的反应中选择性差是此法的一个不足，它可与任何羟基化的芳香族化合物反应，这与它们的实际抗氧化能力关，因此,T,TEACEAC值也包括对抗氧化不起作用的羟基。14六.TBARS法 简介 脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧化物的浓度，氧的去除或氧化产物的形成。因此，反应物(不饱和脂肪酸，自由基等)的消失，氧化产物的定量可能是判断氧化阶段的最合适方法。通过直接或者间接检测氧的消失和自由基的电子自旋光谱，适用于氧化过程的初始阶段。通常采用TBARSTBARS法来评价脂质的过氧化.15七.铁离子还原能力(FRAP)原理 FRAPFRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法。在酸性条件下，FeFe3+3+一TPTATPTA(Fe(Fe3+3+三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成FeFe2+2+一TPTTPTZFZF，溶液变成深蓝色，并且在593593nmnm处有强吸收。FRAPFRAP法具有快速、简便、重复性好等优点。该法不仅用于检测食物及饮料的抗氧化活性。也可用于检测纯天然抗氧化剂的活性。1617.