生物医学中的电镜方法.ppt

参考书参考书生物医学超微结构与电子显微镜技术，洪涛生物医学超微结构与电子显微镜技术，洪涛电子显微镜的原理和使用，朱宜电子显微镜的原理和使用，朱宜生物医学电子显微镜技术，程时生物医学电子显微镜技术，程时生物学中的电子显微镜技术，朱丽霞生物学中的电子显微镜技术，朱丽霞自编讲义（电镜室）自编讲义（电镜室）第一章第一章电子显微镜的基本工作原理及发展简史电子显微镜的基本工作原理及发展简史11 光学显微镜的局限性：理论分辨率及其极限光学显微镜的局限性：理论分辨率及其极限2 2 电子的波动性电子的波动性3 3 磁透镜：磁场对电子束的汇聚作用磁透镜：磁场对电子束的汇聚作用4 4 像差像差ri高压电场下高压电场下100KV,0.037A电子螺旋线运动穿过磁场电子螺旋线运动穿过磁场不同入射角的电子旋转周期相同，不同入射角的电子旋转周期相同，经过一定时间后重新汇聚经过一定时间后重新汇聚运动电子在受到磁场力的作用发生了偏转聚焦运动电子在受到磁场力的作用发生了偏转聚焦f ,MNI K:常数，与透镜几何形状有关常数，与透镜几何形状有关V(伏特伏特):加速电压，加速电压，（相关于电子的能量速度）（相关于电子的能量速度）N:线圈匝数线圈匝数I(安培安培):励磁电流（通过线圈的电流）励磁电流（通过线圈的电流）(相关于磁场强度相关于磁场强度)NI:安培匝数安培匝数透镜极靴透镜极靴可将磁场集中在几个可将磁场集中在几个mm范围范围可将磁场集中增强可将磁场集中增强景深景深A,B,C同时聚焦同时聚焦切片厚切片厚1000埃埃焦深焦深在此范围内接像都是清楚的在此范围内接像都是清楚的像差像差像差概念：像与物的差异像差概念：像与物的差异两类：两类：像差，成像过程中引起 衍射像差，所用电磁波引起磁透镜理想成像条件磁透镜理想成像条件（1）电子轨迹旁轴：离轴距离很近，斜率很小，）电子轨迹旁轴：离轴距离很近，斜率很小，电子速度（波长）相同电子速度（波长）相同（2）磁场分布轴对称磁场分布轴对称 441球差球差透镜边缘部分的聚焦能力强，因而通过透镜近轴的射线透镜边缘部分的聚焦能力强，因而通过透镜近轴的射线和通过透镜边缘的射线与轴相交的位置有远近差别和通过透镜边缘的射线与轴相交的位置有远近差别球差系数孔径角（透镜强度）（透镜强度）最佳孔镜角最佳孔镜角0.01-0.001弧度弧度理论分辨本领理论分辨本领2-3埃埃球差不能克服2 色差色差不同速度（波长）的电磁波通过透镜时将在离透镜不同速度（波长）的电磁波通过透镜时将在离透镜远近不同的点聚焦远近不同的点聚焦 色差系数孔径角物镜电流稳定程度加速电压稳定程度标本厚度色差不能完全克服3像散像散由于透镜磁场不呈轴对称，在两个相互垂直的由于透镜磁场不呈轴对称，在两个相互垂直的方向上焦距不同所引起（方向上焦距不同所引起（固有像散：材料不均匀及加固有像散：材料不均匀及加工装配过程所带来的不对称；非固有像散：污染）工装配过程所带来的不对称；非固有像散：污染）八极式电磁消像散器八极式电磁消像散器像散可消除像散可消除主要透镜下都装消像散器主要透镜下都装消像散器只有把像散减小到可忽略只有把像散减小到可忽略的程度的程度,分辨本领才受球分辨本领才受球差和衍射的限制差和衍射的限制4畸变畸变由球差引起的另一种缺陷由球差引起的另一种缺陷低倍观察时明显低倍观察时明显畸变可通过差透镜组合弥补畸变可通过差透镜组合弥补第二章第二章透射电子显微镜的结构和工作原理透射电子显微镜的结构和工作原理22结构和工作原理结构和工作原理11成像原理成像原理1电子束和样品的作用电子束和样品的作用信息者信息者透射电子透射电子非弹性散射电子；非弹性散射电子；弹型散射电子（小角度，大角度，弹型散射电子（小角度，大角度，背散射）；背散射）；吸收电子吸收电子；二次电子；二次电子；特征特征X射线；射线；11成像原理成像原理 A原子序数原子序数 B原子序数原子序数 A电子散射量电子散射量 B电子散射量电子散射量 在物镜后加一光栏在物镜后加一光栏 A处成像电子处成像电子 B处成像电子处成像电子 （暗）（暗）（亮）（亮）2 反差的形成反差的形成AB携带信息者：携带信息者：散射电子散射电子电子染色：电子染色：C,H,O,N重金属：铅盐（重金属：铅盐（Pb,82）蛋白质，糖元 铀盐（铀盐（U,92）大多数细胞成分均可 四氧化锇（四氧化锇（Os,76）蛋白质，脂类都能与一定的细胞结构结合，都能与一定的细胞结构结合，复染复染物镜光栏越小，图像反差越好物镜光栏越小，图像反差越好 大鼠肝脏超薄切片染色大鼠肝脏超薄切片染色照明系统照明系统聚光系统聚光系统成像系统成像系统放大系统放大系统纪录系统纪录系统22结构和工作原理结构和工作原理电子光学系统电子光学系统（镜筒）（镜筒）电源控制系统电源控制系统（电压电流发生（电压电流发生装置镜筒外）装置镜筒外）真空系统真空系统(泵，镜筒外泵，镜筒外)减少电子途中的碰撞；减少电子途中的碰撞；灯丝寿命灯丝寿命电子枪高压稳定性电子枪高压稳定性标本污染标本污染高压电源，透镜电源高压电源，透镜电源偏转线圈电源，消像散等校正器偏转线圈电源，消像散等校正器真空控制，照相控制，灯丝加热电路真空控制，照相控制，灯丝加热电路1照明系统：电子枪照明系统：电子枪a 阴极阴极(灯丝灯丝)：金属丝钨钨，d0.1-0.2mm发卡式发卡式热离子发射热离子发射b 阳极阳极+-100120KV电压越高电压越高越能穿过较厚样品越能穿过较厚样品价格昂贵价格昂贵c 栅极栅极Vp-+使发射电子数不随使发射电子数不随灯丝温度明显变化灯丝温度明显变化d1mmVp灯丝饱和点灯丝饱和点电子枪的可控参量电子枪的可控参量灯丝温度灯丝温度T或灯丝加热电流或灯丝加热电流灯丝尖离栅极孔外表面的距离（一般固灯丝尖离栅极孔外表面的距离（一般固定）定）负栅压负栅压Vp（一般选择好后固定）（一般选择好后固定）1照明系统：聚光镜照明系统：聚光镜聚光镜按要求把电子束照在标本上聚光镜按要求把电子束照在标本上 距离（长焦距透镜），缩小（短焦距透镜距离（长焦距透镜），缩小（短焦距透镜）调节照明斑大小（视场面极）调节照明斑大小（视场面极）调节照明亮度（标本上的电流密度）调节照明亮度（标本上的电流密度）双聚光镜双聚光镜 最小交叉截面，最小交叉截面，1050光阑光阑消像散消像散标本（样品室）标本（样品室）C1C20.20.750.41.5C2光阑光阑Rcl标本标本聚光镜电流聚光镜电流I光光班班大大小小光光斑斑亮亮度度照明孔径角照明孔径角标本上电流密度标本上电流密度欠焦欠焦过焦过焦正焦正焦聚光镜调节聚光镜调节C1的激励电流用在固定值的激励电流用在固定值照明束斑的大小及亮度由照明束斑的大小及亮度由C2激励电流调节激励电流调节聚光镜光阑（聚光镜光阑（200400 ）选择）选择（否则球差）（否则球差）Rc ,亮度亮度 ，球差，球差 ，权衡权衡：标本较厚，标本较厚，Rc 标本娇，搞分辨标本娇，搞分辨Rc 在光强允许范围内应尽量在光强允许范围内应尽量Rc聚光镜消像散聚光镜消像散2成像系统成像系统物镜：物镜：成像系统的第一级成像透镜成像系统的第一级成像透镜心脏心脏物镜光阑：小的优点物镜光阑：小的优点图像反差；球差（分辨率）；图像反差；球差（分辨率）；小的缺点小的缺点亮度；污染亮度；污染 物镜消像散：按精度的不同要求有几种方法物镜消像散：按精度的不同要求有几种方法 最简单的（最简单的（10埃分辨率）像散线法埃分辨率）像散线法聚焦：调节物镜电流聚焦：调节物镜电流(使物镜像平面重于放大镜像平面使物镜像平面重于放大镜像平面)放大镜放大镜物镜物镜中间镜，投影镜：改变放大倍数中间镜，投影镜：改变放大倍数 通常投影镜的强度是个固定值通常投影镜的强度是个固定值 调节中间镜电流获得所需放大倍数调节中间镜电流获得所需放大倍数 （中间镜像平面固定，物平面移动）（中间镜像平面固定，物平面移动）最高放大倍数最高放大倍数MT500,0001,000,000高放大倍数高放大倍数MT50,000500,000中中放大倍数放大倍数MT10,00050,000低低放大倍数放大倍数MT 10010003记录观察系统记录观察系统 荧光屏荧光屏：硫化锌（镉）类荧光粉硫化锌（镉）类荧光粉 电子束射入后发黄绿色光电子束射入后发黄绿色光在低电流密度下发光强度大，在低电流密度下发光强度大，分辨率高（分辨率高（50 ），发光光谱合适（暗适应的眼睛对此），发光光谱合适（暗适应的眼睛对此最敏感），余辉适中最敏感），余辉适中 屏前放大望远镜屏前放大望远镜：510倍，观察微小细节，聚焦倍，观察微小细节，聚焦 照像室照像室：位于荧光屏下方，移走屏可同样清晰成像，位于荧光屏下方，移走屏可同样清晰成像，保存图像使用，卤化银型感光底片，保存图像使用，卤化银型感光底片，4 电子显微镜的对中和调整电子显微镜的对中和调整对中和调整的需要对中和调整的需要机械合轴机械合轴光学合轴（偏转线圈）光学合轴（偏转线圈）