1、实验二 沉淀试验 目的要求 1、掌握炭疽杆菌环状沉淀试验的操作技 术和结果观察。2、掌握炭疽杆菌琼脂扩散试验的基本操 作技术和结果观察。沉淀试验：可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相 应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验 抗原沉淀原抗体沉淀素 沉淀试验的类型：液相沉淀试验 环状沉淀试验 絮状沉淀试验 固相沉淀试验 琼脂凝胶扩散试验 免疫电泳技术 实验材料1 1、炭疽沉淀血清、炭疽沉淀血清 由兽医生物药品厂生产供应。该血清是由免由兽医生物药品厂生产供应。该血清是由免 疫的马血清分离。首免用炭疽芽孢苗，再以疫的马血清分离。首免
2、用炭疽芽孢苗，再以 炭疽强毒的死菌按炭疽强毒的死菌按3 34d4d的间隔，进行的间隔，进行3 34 4次次 加强免疫，抗体效价达到要求时，采血分离加强免疫，抗体效价达到要求时，采血分离 血清。血清。2 2、炭疽沉淀抗原、炭疽沉淀抗原 由兽医生物药品厂生产供应。由兽医生物药品厂生产供应。3 3、待检抗原、待检抗原l l冷浸法冷浸法 用于待检皮张，检样置用于待检皮张，检样置37C37C温箱烘干，高压灭温箱烘干，高压灭菌后，剪成小块称重，然后加入菌后，剪成小块称重，然后加入5 51010倍的石炭倍的石炭酸生理盐水，放室温浸泡酸生理盐水，放室温浸泡181824h24h，用滤纸过滤，用滤纸过滤2 23
3、3次，使之呈清朗的液体，即为待检抗原。次，使之呈清朗的液体，即为待检抗原。l l热浸法热浸法 用于待检的组织脏器，取怀疑死于炭疽病畜的用于待检的组织脏器，取怀疑死于炭疽病畜的脏器（脾、肝、肾、血液或肌肉等），放入乳脏器（脾、肝、肾、血液或肌肉等），放入乳钵内研磨碎，加钵内研磨碎，加5 51010倍生理盐水，装入试管或倍生理盐水，装入试管或小三角瓶中，煮沸小三角瓶中，煮沸303040min40min，冷却后用滤纸过，冷却后用滤纸过滤数次，直到滤液透明，即为待检抗原。滤数次，直到滤液透明，即为待检抗原。4 4、生理盐水、生理盐水 （一）炭疽环状沉淀试验方法与步骤:取取3 3支口径支口径0.4cm0
4、4cm的小试管，在其底部各加约的小试管，在其底部各加约 0.1ml0.1ml的炭疽沉淀血清。的炭疽沉淀血清。取其取其1 1支，用毛细管将待检抗原沿着管壁重支，用毛细管将待检抗原沿着管壁重 叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐 的界面，注意勿产生气泡。的界面，注意勿产生气泡。另另2 2支小试管，一支加炭疽阳性抗原，另一支小试管，一支加炭疽阳性抗原，另一 支加生理盐水，作为对照。（如图）支加生理盐水，作为对照。（如图）炭疽环状沉淀试验加样式意图炭疽环状沉淀试验加样式意图炭疽环状沉淀试验加样式意图炭疽环状沉淀试验加样式意图结果判定结果判定 5 510min1
5、0min内判定结果，上下重叠两液界面内判定结果，上下重叠两液界面 上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组 中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加 生理盐水者应不出现白环。生理盐水者应不出现白环。（二）炭疽琼脂扩散试验 方法与步骤：琼脂板制备琼脂板制备 称取称取1g1g琼脂粉，加至琼脂粉，加至100ml 0.5%100ml 0.5%石炭酸生理石炭酸生理 盐水中，煮沸使之溶解。待温度降至盐水中，煮沸使之溶解。待温度降至5555左左 右时浇玻板，厚约右时浇玻板，厚约2 23mm3mm左右。左右。打孔打孔 在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为
6、在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2mm2mm，中间孔，中间孔 和周围孔间的距离大约为和周围孔间的距离大约为3mm3mm。加样加样 中间孔加炭疽沉淀血清，周围孔中分别加炭中间孔加炭疽沉淀血清，周围孔中分别加炭 疽沉淀抗原、待检抗原及盐水。（如图）疽沉淀抗原、待检抗原及盐水。（如图）炭疽琼脂扩散试验加样式意图炭疽琼脂扩散试验加样式意图 作用作用 将琼脂凝胶板放置湿盒中，于将琼脂凝胶板放置湿盒中，于3737扩散扩散2424 72h72h，每天观察结果，观察三天。，每天观察结果，观察三天。结果观察结果观察 抗原抗体扩散时，在两孔间比例最合适的位抗原抗体扩散时，在两孔间比例最合适的位 置出现白色沉淀线，出现白色沉淀线即为阳置出现白色沉淀线，出现白色沉淀线即为阳 性反应，不出现白色沉淀线为阴性反应。性反应，不出现白色沉淀线为阴性反应。炭疽琼脂扩散试验结果炭疽琼脂扩散试验结果
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