分子生物学技术原理.ppt

分子生物学技术分子生物学技术1 1第一节分子生物学技术原理2 2细胞的分子基础3 3基因是生物进化的物质基础4 4SpeciesGenome size(Mb)Number of chromosomesHuman30002n=46Mouse27002n=40Pig 27002n=38Cow 30002n=60Fugu 400Zebrafish 17002n=50Chicken 12002n=78Honey bee180n=16Drosophila1652n=8C.elegans 1002n=12Rise 4302n=24Wheat 17,0002n=6x=42Arabidopsis 1002n=10Tomato 9502n=24Maize25002n=20White Spruce10,0002n=24S.cerevisiae15n=16E.coli4.7n=1H.influenze1.8n=1Mycoplasma genitalium0.58n=1Genome data for plant and animal species5 5基因（gene）：核酸分子中储存遗传信核酸分子中储存遗传信息的遗传单位。即储存有功能的蛋白质息的遗传单位。即储存有功能的蛋白质多肽链或多肽链或RNA序列信息及表达这些信息序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列所必需的全部核苷酸序列。基因组（genome）：）：细胞或生物体中，细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。一套完整单倍体的遗传物质的总和。6 6基因与疾病染色体缺陷新生儿畸形、愚钝细胞分裂、增殖相关基因突变肿瘤免疫相关基因缺陷自身免疫病、抗感染差生化代谢过程基因缺陷解毒功能差、易受环境因素致癌7 7基因组计划人类基因组计划(human genome project,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。我国于1999年9月积极参加到这项研究计划中的，承担其中1%的任务，即人类3号染色体上约3000万个碱基对的测序任务。8 8细胞核是细胞代谢、生长、分化的控制枢纽9 9DNA分子携带遗传信息101011111212DNA的结构与功能1313DNA主要功能是贮存复制和传递遗传信息主要功能是贮存复制和传递遗传信息1414遗传信息的传递1515161617171818中心法则191920202121蛋白质分子结构222223232424252526262727 理解遗传因素如何影响人类疾病的探索正在加速进行2828第二节核酸分子杂交技术与应用核酸分子杂交技术与应用2929一、核酸分子杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理（一）核酸分子杂交的基本原理（一）核酸分子杂交的基本原理1 1、变性（、变性（denaturationdenaturation）（1 1）定义：）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。开，形成无规则线团，双链解链成为单链。3030（2 2 2 2）.引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素酸酸酸酸碱碱碱碱热热热热变性剂变性剂变性剂变性剂（尿素）（尿素）（尿素）（尿素）有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂（乙醇）（乙醇）（乙醇）（乙醇）31312 2、融解温度：、融解温度：定义：在定义：在DNADNA热变性时，其热变性时，其A260A260的升高达最的升高达最 大值一半时的温度。大值一半时的温度。3232影响影响影响影响TmTmTmTm的因素：的因素：的因素：的因素：（1 1 1 1）DNADNADNADNA碱基的组成碱基的组成碱基的组成碱基的组成 G-CG-CG-CG-C含量越多含量越多含量越多含量越多 TmTmTmTm值越高值越高值越高值越高 A-TA-TA-TA-T含量越多含量越多含量越多含量越多 TmTmTmTm值越低值越低值越低值越低3333（2 2 2 2）溶液的离子强度）溶液的离子强度）溶液的离子强度）溶液的离子强度 低离子强度低离子强度低离子强度低离子强度 TmTmTmTm值越低值越低值越低值越低 高离子强度高离子强度高离子强度高离子强度 TmTmTmTm值越高值越高值越高值越高（3 3 3 3）pHpHpHpH值值值值 pHpHpHpH值值值值5-9 Tm5-9 Tm5-9 Tm5-9 Tm值变化不明显值变化不明显值变化不明显值变化不明显 pH11 pH11 pH11 pH11 不利于氢键形成不利于氢键形成不利于氢键形成不利于氢键形成（4 4 4 4）变性剂）变性剂）变性剂）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成干扰碱基堆积力和氢键的形成干扰碱基堆积力和氢键的形成干扰碱基堆积力和氢键的形成34343 3、复性、复性 变性变性DNADNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：DNADNA浓度浓度 DNADNA片段的大小片段的大小 DNADNA片段复杂性片段复杂性 合适的复性温度合适的复性温度 适当的离子强度适当的离子强度35354 4、杂交、杂交 定义定义定义定义 两条两条两条两条来源不同来源不同来源不同来源不同，但具有，但具有，但具有，但具有互补序列互补序列互补序列互补序列的核酸，按的核酸，按的核酸，按的核酸，按碱基配碱基配碱基配碱基配对对对对原则原则原则原则复性复性复性复性形成一个杂交体，形成一个杂交体，形成一个杂交体，形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子这个过程即杂交，或称分子这个过程即杂交，或称分子这个过程即杂交，或称分子杂交。杂交。杂交。杂交。分类分类分类分类DNA-DNADNA-DNADNA-RNADNA-RNARNA-RNARNA-RNA36363737(二二)核酸探针核酸探针概念概念 探针（探针（probeprobe）指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。被特殊方法所检测的分子。例如抗原例如抗原-抗体、生物素抗体、生物素-亲和素等均可看成是亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。探针与靶分子的相互作用。核酸探针核酸探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链非同位素标记）的核苷酸链。38383939二、分子杂交技术二、分子杂交技术 液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片（一）液相分子杂交（一）液相分子杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。去，即得到杂交后的核酸分子。4040（二）固相分子杂交（二）固相分子杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶交分子容易被检测，能防止靶DNADNA的自我复性，故的自我复性，故被广泛应用。被广泛应用。41411 1、SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 膜上检测膜上检测DNADNA的杂交技术，的杂交技术，19751975年由年由Edwin Edwin SouthernSouthern建立。利用这一技术可进行克隆基因建立。利用这一技术可进行克隆基因DNADNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。性等。424243432 2、NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交 应用应用DNADNA探针检测特异探针检测特异mRNAmRNA的一种杂交的一种杂交技术，主要用于分析技术，主要用于分析mRNAmRNA的转录或的转录或mRNAmRNA分子分子大小，其方法类似于大小，其方法类似于SouthernSouthern印迹杂交。印迹杂交。44443 3、原位杂交、原位杂交定义：定义：将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（表达的检测技术称为原位杂交（hybridization hybridization inin situ situ)。2 2、操作步骤：、操作步骤：载片的清洁与处理载片的清洁与处理 组织与细胞的固定组织与细胞的固定 探针探针 湿盒湿盒454546464、基因芯片技术、基因芯片技术 是集成化的核酸分子杂交技术。是集成化的核酸分子杂交技术。4747第三节 PCR技术原理与应用4848PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKary B.Mullis B.Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）1971 Khorana等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。4949体内体内DNADNA的复制体系的复制体系拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTPdNTPdNTPdNTP Mg Mg Mg Mg2+2+2+2+5 5 335050Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段5151TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermusthermus aquaticusaquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。5252PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸5353 PCRPCRPCRPCR的指数扩增（的指数扩增（的指数扩增（的指数扩增（2 2 2 2n n n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火5454TaqTaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 P2DNA聚合酶：聚合酶：Taq原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液辅助因子：辅助因子：Mg2+55551PCR1PCR反应成分反应成分（1 1 1 1）模板）模板）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。DNADNA模板一般模板一般100ng/100100ng/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件5656（2 2 2 2）引物）引物）引物）引物 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3 3 3 3）TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。5757（4 4 4 4）dNTPdNTPdNTPdNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降浓度过低则降低反应产量低反应产量 dNTPdNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合,使游离的使游离的Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。5858（5 5 5 5）Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-0.5-2.5mmol/L2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+Mg2+浓度。浓度。59592 2 2 2 循环参数循环参数循环参数循环参数(1)(1)变性变性变性变性 (2)使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 9494，20-3020-30秒秒(2)(2)(2)(2)退火退火退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。复性温度复性温度=Tm值值-(510)增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降降低温度可增加反应的灵敏性。低温度可增加反应的灵敏性。6060（3 3 3 3）延伸）延伸）延伸）延伸 70-75,70-75,一般为一般为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4 4 4）循环次数）循环次数）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加61613.3.反应完成后反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀比例混匀,上样电泳。上样电泳。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳6262PCR技术的特点1 1 1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性30303030轮循环轮循环轮循环轮循环扩增量达扩增量达10109 9拷贝拷贝PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍63632 2 2 2）特异性）特异性）特异性）特异性引物引物引物引物引物引物引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反反 应结果的关键。应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。6464引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源与非扩增区无同源 序列。序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 15-40 bpbp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。65653 3 3 3）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行 利用利用PCRPCR扩增扩增,只需要数小时只需要数小时,就可以扩增出就可以扩增出 可用可用电泳法检出的电泳法检出的DNADNA，可用于检测基因组中仅含数个拷，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。贝的模板序列。6666应用定性研究：定性研究：用于检测特定基因序列的存在或缺失用于检测特定基因序列的存在或缺失定量研究：定量研究：用于定量检测目的基因用于定量检测目的基因6767用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳1236868LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-PCR（LabelledLabelledLabelledLabelled primers)primers)primers)primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标利用同位素、荧光素等对引物进行标记记,用以直观地检测目的基因。用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分6969标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物7070原位原位原位原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。位和检测病理切片中含量较少的靶序列。7171操作步骤操作步骤1.1.细细胞胞或或组组织织固固定定：细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处处理理后后便便适于一般适于一般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达7272逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增7373荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针针,对对PCRPCR产物进行标记跟踪产物进行标记跟踪,实时在线监控反实时在线监控反应过程应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 AmplifluorAmplifluor(IntergenIntergen)7474与普通与普通PCR的区别的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。75757676每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。7777定量PCR的数学原理78787979斜率与扩增效率80808181荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan82821、SYBR Green 法8383SYBR Green 熔解曲线分析8484SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜85852、TaqMan探针法8686TaqMan作用机理8787TaqMan法优缺点8888 Real-time PCR 方法应用方法应用8989绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究9090绝对定量与相对定量的定义9191绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物9292绝对定量：从荧光到拷贝数9393相对定量通过内标定量内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量9494相对定量分析方法：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F=对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度9595 定量PCR的实验要素9696样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL9797标准品9898标准品梯度稀释方法9999复管测试样品和标准品都要重复重复次数须遵循统计学要求100100平台PCR仪介绍ABI 7500 fast101101 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪102102103103THANKS!104104