蛋白质共价结构-生物化学-PPT.ppt

蛋白质共价结构蛋白质共价结构-生物化学生物化学蛋白质共价结构内容提要蛋白质共价结构内容提要重点：重点：l 肽的结构和性质肽的结构和性质掌握：掌握：l 肽段中氨基酸序列的测定方法肽段中氨基酸序列的测定方法了解：了解：l 肽和蛋白质的人工合成肽和蛋白质的人工合成4-1 4-1 蛋白质通论蛋白质通论蛋白质概念蛋白质概念蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成蛋白质的分类蛋白质的分类蛋白质的大小和分子量蛋白质的大小和分子量蛋白质的构象蛋白质的构象蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性蛋白质氨基酸顺序的遗传编码蛋白质氨基酸顺序的遗传编码一、蛋白质概念一、蛋白质概念蛋白质是由蛋白质是由2020种种a-a-氨基酸通过肽键组成的高分氨基酸通过肽键组成的高分子有机物子有机物.二、蛋白质的化学组成二、蛋白质的化学组成蛋白质由蛋白质由C、H、O、N四种元素组四种元素组成，多数含有成，多数含有S，有的含有微量铁、，有的含有微量铁、铜、锌、碘和磷等元素。铜、锌、碘和磷等元素。各种蛋白质的含氮量都接近于各种蛋白质的含氮量都接近于1616蛋白质含量蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮 6.25 6.256.256.25为蛋白质系数，即为蛋白质系数，即1 1克氮所代克氮所代表的蛋白质量（克数）表的蛋白质量（克数）凯氏（凯氏（KjedahlKjedahl）定氮法测定蛋白）定氮法测定蛋白质含量的基础。质含量的基础。碳碳 5050-55%-55%氢氢 6.5-7.36.5-7.3氧氧 19-2419-24氮氮 16%16%硫硫 0-30-3其他其他 微微 量量三、蛋白质的分类三、蛋白质的分类蛋白质分子形状：蛋白质分子形状：l球状蛋白质：球状蛋白质：globular proteinglobular protein 对称性好，溶解度高，能结晶，多数蛋白质属于此类；对称性好，溶解度高，能结晶，多数蛋白质属于此类；l纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：fibrous proteinfibrous protein 对称性差，分为：可溶性纤维状蛋白质（肌球蛋白）；对称性差，分为：可溶性纤维状蛋白质（肌球蛋白）；不溶性纤维状蛋白质（胶原蛋白、丝心蛋白等）。不溶性纤维状蛋白质（胶原蛋白、丝心蛋白等）。蛋白质分子组成：蛋白质分子组成：l简单蛋白质：简单蛋白质：(simple protein)(simple protein)完全由氨基酸构成，如胰岛素；完全由氨基酸构成，如胰岛素；l结合蛋白质：结合蛋白质：(conjugated protein)(conjugated protein)由蛋白质和辅基组成，如血红蛋白等。由蛋白质和辅基组成，如血红蛋白等。生物功能：生物功能：l酶、结构蛋白、防御蛋白等。酶、结构蛋白、防御蛋白等。四、蛋白质的大小和分子量四、蛋白质的大小和分子量 分子量变化范围分子量变化范围从大约从大约6,0006,000到到1,000,0001,000,000道尔顿道尔顿(dation)(dation)或更或更大。蛋白质分子量的上下限是人为规定的。在大。蛋白质分子量的上下限是人为规定的。在表示蛋白质分子量时应说明测定方法表示蛋白质分子量时应说明测定方法(层析、层析、电泳、质谱）。电泳、质谱）。有些寡聚蛋白质的分子量高达数百万甚至数千有些寡聚蛋白质的分子量高达数百万甚至数千万，例如烟草花叶病毒（万，例如烟草花叶病毒（TMV），），“分子量分子量”约约4107。大家应该也有点累了，稍作休息大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流8五、蛋白质的构象五、蛋白质的构象肽链形成的蛋白质的特有的空间结构即为蛋白质的构肽链形成的蛋白质的特有的空间结构即为蛋白质的构象。象。如蛋白质二级结构：如蛋白质二级结构：a-a-螺旋、螺旋、-折叠等。折叠等。六、蛋白质功能的多样性六、蛋白质功能的多样性作为有机体新陈代谢的催化剂（酶）。作为有机体新陈代谢的催化剂（酶）。生物体的结构成分生物体的结构成分(胶元蛋白胶元蛋白)。贮藏功能（作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的贮藏功能（作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。）原料。）运输功能（血红蛋白）。运输功能（血红蛋白）。运动功能（肌动蛋白和肌球蛋白）运动功能（肌动蛋白和肌球蛋白）调节功能（激素）调节功能（激素）参与高等动物的免疫反应（抗体和免疫蛋白）。参与高等动物的免疫反应（抗体和免疫蛋白）。控制或调节遗传物质核酸的作用（组蛋白）。控制或调节遗传物质核酸的作用（组蛋白）。七、蛋白质氨基酸顺序的遗传编码七、蛋白质氨基酸顺序的遗传编码三个连续的碱基顺序为一个密码单位即密码三个连续的碱基顺序为一个密码单位即密码子或密码三联体，每个三联体代表一个氨基子或密码三联体，每个三联体代表一个氨基酸。酸。每条多肽链的氨基酸顺序由每条多肽链的氨基酸顺序由RNARNA的碱基顺序决的碱基顺序决定，而定，而RNARNA的碱基顺序决定于的碱基顺序决定于DNADNA，因此一条，因此一条多肽链的氨基酸顺序最终由多肽链的氨基酸顺序最终由DNADNA分子中的一段分子中的一段碱基顺序所决定。碱基顺序所决定。4-2 4-2 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构-肽（肽（peptidepeptide）一、蛋白质的一一、蛋白质的一级结构级结构二、肽键的性质二、肽键的性质三、肽平面三、肽平面四、肽链的方向四、肽链的方向性性五、天然存在的五、天然存在的活性肽活性肽A A链链B B链链A A链链2121个个aaaa残基残基B B链链3030个个aaaa残基残基一个链内二硫键一个链内二硫键两个链间二硫键两个链间二硫键分子量分子量57005700一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构19691969年，国际纯化学与应用化学年，国际纯化学与应用化学委员会（委员会（IUPACIUPAC）规定：蛋白质）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中的一级结构指蛋白质多肽连中AAAA的排列顺序，包括二硫键的位置。的排列顺序，包括二硫键的位置。多肽链即为蛋白质一级结构的主多肽链即为蛋白质一级结构的主体。体。-NCCNCC-寡肽：由寡肽：由2-10个氨基酸组成的肽个氨基酸组成的肽。一个氨基酸的羧基与另一个一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。氨基酸残基。二、肽键（二、肽键（peptide bondpeptide bond）-C-N-C-N-比大多数比大多数C-NC-N键短，具有部分双键短，具有部分双键性质，不能自由键性质，不能自由旋转。旋转。-C-N-C-N-键上的键上的H H和和O O原原子是反式的。子是反式的。组成肽键的原子处组成肽键的原子处于同一平面。于同一平面。0.127nm 0.127nm键长键长=0.132nm=0.132nm 0.148nm 0.148nm三、肽平面三、肽平面-CO-NH-CO-NH-中的四个原子和与中的四个原子和与它相邻的两个它相邻的两个CaCa在一个平在一个平面上。面上。四、肽链的方向性四、肽链的方向性在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨氨基，称为氨基端或基端或N-N-端；在另一端含有一个游离的端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-C-端。端。氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨端氨基酸残基为终点的排列顺序。如果基酸残基为终点的排列顺序。如果C-C-端有端有NH2NH2，说明，说明C-C-端酰化端酰化五、天然存在的活性肽（五、天然存在的活性肽（active peptideactive peptide）生物体内以游离态存在的生物体内以游离态存在的分子量较小的多肽，分子量较小的多肽，这类这类多肽通常都具有特殊的生多肽通常都具有特殊的生理功能。理功能。如催产素、加压素、谷胱如催产素、加压素、谷胱甘肽、甘肽、脑啡肽、激素类多脑啡肽、激素类多肽、抗菌肽、蛇毒多肽等。肽、抗菌肽、蛇毒多肽等。谷胱甘肽谷胱甘肽CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOH CHCH2 2SHSH 谷胱甘肽谷胱甘肽存在与动、植物及存在与动、植物及微生物中：微生物中：1.1.参与体内氧化还原反应参与体内氧化还原反应2.2.作为辅酶参与氧化还原反应作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基酶或含保护巯基酶或含CysCys的蛋白质中的蛋白质中SHSH的还的还原性，原性，防止氧化物积累防止氧化物积累4-3 4-3 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础基础蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。不同蛋白质的一级结构被测定。一、一、测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）；以上）；知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。个数。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。蛋白质一级结构测定的基本策略蛋白质一级结构测定的基本策略1、测定蛋白质中多肽链的数目；测定蛋白质中多肽链的数目；2 2、拆分蛋白质分子的多肽链，分离纯化各肽链；、拆分蛋白质分子的多肽链，分离纯化各肽链；3 3、拆开多肽链内的二硫键；、拆开多肽链内的二硫键；4 4、分析各肽链的氨基酸组成；、分析各肽链的氨基酸组成；5 5、鉴定多肽链的氨基末端残基和羧基末端残基；、鉴定多肽链的氨基末端残基和羧基末端残基；6 6、用两种不同的裂解方式裂解多肽链成较小的片段；、用两种不同的裂解方式裂解多肽链成较小的片段；7 7、测定各片段的氨基酸顺序；、测定各片段的氨基酸顺序；8 8、用片段重叠法重建完整多肽链的一级结构；、用片段重叠法重建完整多肽链的一级结构；9 9、确定二硫键的形成方式。、确定二硫键的形成方式。测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。间的关系，即可确定多肽链的数目。多肽链的拆分多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8 8mol/Lmol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸盐酸胍处理，即可分开多肽链胍处理，即可分开多肽链(亚基亚基).).二硫键的断裂二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8 8mol/Lmol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂为巯基，然后用烷基化试剂（ICHICH2 2COOHCOOH）保护生成的巯基，以防保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。止它重新被氧化。巯基（巯基（-SH-SH）的保护）的保护几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).4 4、氨基酸组成的测定氨基酸组成的测定酸水解是主要水解方法，同时辅以碱水解。酸水解是主要水解方法，同时辅以碱水解。一般用一般用 6mol6molL HClL HCl于于110110o oC C在真空充氮的安玻瓶在真空充氮的安玻瓶内进行水解，时间内进行水解，时间10102424小时。小时。l所得氨基酸不消旋，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸、所得氨基酸不消旋，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰苏氨酸和酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。胺基被水解下来。酰胺基：总量可由水解液中的氮量算出酰胺基：总量可由水解液中的氮量算出 色氨酸：可用碱水解蛋白质，能定量回收色氨酸。色氨酸：可用碱水解蛋白质，能定量回收色氨酸。蛋白质中氨基酸组成表示方法：蛋白质中氨基酸组成表示方法：l每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示l每每100100克蛋白质中含氨基酸的克数表示。克蛋白质中含氨基酸的克数表示。N-N-末端分析方法末端分析方法多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基酸端氨基酸(amino-(amino-terminal)terminal)和和C-C-端氨基酸。端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分端氨基酸分析法。析法。（1 1）二硝基氟苯（）二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法（2 2）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（DNSDNS）法）法（3 3）苯异硫氰酸酯（）苯异硫氰酸酯（PTCPTC）法）法（4 4）氨肽酶法）氨肽酶法（1 1）二硝基氟苯（）二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。（2 2）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（DNSDNS）法）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的游端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。灵敏度比。灵敏度比DNFBDNFB法高法高100100倍倍水解后的水解后的DNS-DNS-氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。（3 3）苯异硫氰酸酯（）苯异硫氰酸酯（PTCPTC）法）法多肽或蛋白质的末端氨基能与多肽或蛋白质的末端氨基能与PITCPITC作用，生成苯氨基作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（硫甲酰多肽或蛋白质（PTC-PTC-多肽或蛋白质），它们在多肽或蛋白质），它们在酸性有机溶剂中加热时，酸性有机溶剂中加热时，N N末端的末端的PTC-PTC-氨基酸发生环化，氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱离。生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱离。脱去脱去N N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。重复反应可以用来测定氨基酸顺序。重复反应可以用来测定氨基酸顺序。（4 4）氨肽酶法）氨肽酶法氨肽酶是一类肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一类肽链外切酶，它能从多肽链的N N端逐个地端逐个地切下氨基酸。切下氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的能知道该蛋白质的N N末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。C C末端测定的方法末端测定的方法肼解法；还原法；羧肽酶法肼解法；还原法；羧肽酶法（1 1）肼解法）肼解法是目前测定是目前测定C C末端残基最重要的化学方法。末端残基最重要的化学方法。多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸端氨基酸分离。分离。（2 2）还原法）还原法肽链肽链C C末端氨基酸也可用硼氢化鋰还原成相应末端氨基酸也可用硼氢化鋰还原成相应的的a-a-氨基醇。氨基醇。肽链完全水解后，代表原来肽链完全水解后，代表原来C C末端的末端的a-a-氨基醇，氨基醇，可用层析法加以鉴别。可用层析法加以鉴别。（3 3）羧肽酶法）羧肽酶法羧肽酶是一种肽外切酶，它能从多肽链羧肽酶是一种肽外切酶，它能从多肽链C-C-端逐个水解。根端逐个水解。根据不同的反应时间测酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，据不同的反应时间测酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸末端氨基酸残基；残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。多肽链的部分断裂和肽段的分离多肽链的部分断裂和肽段的分离可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。开来。酶解法（常用的都是内切酶）酶解法（常用的都是内切酶）A A、胰蛋白酶；、胰蛋白酶；B B、糜蛋白酶；糜蛋白酶；C C、嗜热菌蛋白酶；、嗜热菌蛋白酶；D D、胃蛋白酶、胃蛋白酶化学裂解法：化学裂解法：A A、溴化氰；、溴化氰；B B、羟氨、羟氨肽段的分离提纯肽段的分离提纯多肽链断裂法：酶解法和化学法多肽链断裂法：酶解法和化学法胰蛋白酶胰蛋白酶 T Trypsinaserypsinase要减少胰蛋白酶的作用位点：要减少胰蛋白酶的作用位点：l可通过化学修饰将其侧链基团保护起来。可通过化学修饰将其侧链基团保护起来。LysLys：马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护：马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护-NH-NH2 2，则不被水解；，则不被水解；ArgArg：用：用1 1，2-2-环己二酮修饰胍基，则不被水解。环己二酮修饰胍基，则不被水解。l增加胰蛋白酶的断裂点：增加胰蛋白酶的断裂点：用氮丙啶处理，则用氮丙啶处理，则CysCys残基侧链被修饰成类似残基侧链被修饰成类似LysLys的侧链，也具的侧链，也具有有-NH-NH2 2，胰蛋白酶就能断裂，胰蛋白酶就能断裂CysCys羧基侧的肽键。羧基侧的肽键。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2B B、糜蛋白酶、糜蛋白酶 C Chymotrypsinhymotrypsin R R1 1=Phe,Trp,Tyr=Phe,Trp,Tyr时水解快时水解快;R R1 1=Leu=Leu，MetMet和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑制水解受抑制 要求：溶液要求：溶液pH8pH89 9-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶 thermolysinthermolysinR R2 2=Phe,Trp,Tyr;Leu=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,MetIle,Met以及其它疏水性以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。强的氨基酸水解速度较快。R R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑制。水解受抑制。R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑制。水解受抑制。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2胃蛋白酶胃蛋白酶 P PepsinepsinR R1 1和和R R2 2Phe,Trp,Tyr;LeuPhe,Trp,Tyr;Leu以及其它以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。如疏水性氨基酸水解速度较快。如PhePhePhePhe。R R1 1=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。要求：要求：pH2 pH2 由于二硫键在酸性条件稳定，因此确由于二硫键在酸性条件稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。解。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R1R2R2溴化氰溴化氰只断裂由甲硫氨酸残基的羧基形成的肽键。只断裂由甲硫氨酸残基的羧基形成的肽键。蛋白质甲硫氨酸含量很少，因此蛋白质甲硫氨酸含量很少，因此CNBrCNBr裂解产生的肽段裂解产生的肽段不多不多 水解产生的肽段可用胰蛋白酶处理成更小的肽段。水解产生的肽段可用胰蛋白酶处理成更小的肽段。羟氨羟氨专一性裂解专一性裂解Asn-Gly-Asn-Gly-之间的肽键，专一性不强之间的肽键，专一性不强部分裂解部分裂解Asn-LeuAsn-Leu及及Asn-AlaAsn-Ala键键由于各种蛋白质中由于各种蛋白质中AsnAsnGlyGly键出现的几率很低，所以键出现的几率很低，所以水解得到的肽段都很大水解得到的肽段都很大用于分子量大的蛋白质的测序。用于分子量大的蛋白质的测序。肽段的分离提纯肽段的分离提纯肽段混合物常用以下方法进行分离提纯：肽段混合物常用以下方法进行分离提纯：凝胶过滤凝胶过滤凝胶电泳凝胶电泳离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换葡聚糖柱层析离子交换葡聚糖柱层析高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLC）高效薄层层析高效薄层层析肽段氨基酸顺序的测定肽段氨基酸顺序的测定主要使用主要使用EdmanEdman化学降解法，还有酶解法、酶解化学降解法，还有酶解法、酶解-肽谱肽谱重叠法及气谱重叠法及气谱-质谱联用法等。质谱联用法等。EdmanEdman化学降解法（化学降解法（PITCPITC法）：法）：lP.EdmanP.Edman于于19501950年首先提出来的。年首先提出来的。l最初用于最初用于N N末端残基分析。末端残基分析。l降解试剂：苯异硫氰酸酯（降解试剂：苯异硫氰酸酯（PITCPITC），能够不断重复），能够不断重复循环，将肽链循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行解离。端氨基酸残基逐一进行解离。EdmanEdman化学降解法（化学降解法（PITCPITC法法）PTH-氨基酸非常稳定，在紫外区有强吸收，最大吸收值在氨基酸非常稳定，在紫外区有强吸收，最大吸收值在268nm处。处。PTH-氨基酸可用各种层析技术分离。氨基酸可用各种层析技术分离。多肽链中肽段次序的决定多肽链中肽段次序的决定（1 1）确定多肽链）确定多肽链 C C端和端和 N N端氨基酸残基端氨基酸残基（2 2）需要两套成几套）需要两套成几套不同方法断裂得到的肽不同方法断裂得到的肽段段（3 3）借助两套肽段中）借助两套肽段中的重叠肽确定肽段在多的重叠肽确定肽段在多肽链中的位置。肽链中的位置。A A法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：A1 Ala-PheA1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-Val A4 His-ValB B法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：B1 Ala-Phe-Gly-LysB1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr-His-Val B3 Tyr-His-Val二硫键位置确定二硫键位置确定一般采用胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白质。一般采用胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白质。l水解专一性比较低，切点多，生成含有二硫桥的肽水解专一性比较低，切点多，生成含有二硫桥的肽段小，易分离、鉴定；段小，易分离、鉴定；l作用作用pHpH在酸性范围（在酸性范围（2 2），可防止二硫键发生交换），可防止二硫键发生交换反应。反应。水解得到的肽段混合物可用水解得到的肽段混合物可用BrownBrown及及HartlnyHartlny对角线电对角线电泳技术分离。泳技术分离。+-+-第第二二向向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑两个斑点是由一个二硫点是由一个二硫键断裂产生的肽键断裂产生的肽段段二硫键位置确定二硫键位置确定4-4 4-4 多肽与蛋白质的人工合成多肽与蛋白质的人工合成一、多肽的人工合成有两种类型：一、多肽的人工合成有两种类型：l1 1、由不同氨基酸按一定顺序控制合成、由不同氨基酸按一定顺序控制合成l2 2、由一种或两种氨基酸聚合或共聚合、由一种或两种氨基酸聚合或共聚合二、接肽反应的保护基：二、接肽反应的保护基：l氨基保护基：氨基保护基：苄氧甲酰基（最常用）、三苯甲基、叔苄氧甲酰基（最常用）、三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，它们可用丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，它们可用HBrHBrCHCH3 3COOHCOOH在室温下除去。在室温下除去。l羧基保护基：羧基保护基：一般以盐或酯的形式保护。一般以盐或酯的形式保护。三、羧基、氨基活化：三、羧基、氨基活化：羧基的活化：羧基的活化：l叠氮法、混合酸酐法和活化酯法叠氮法、混合酸酐法和活化酯法 ，酰氯法，酰氯法 氨基的活化：氨基的活化：l通常是在接肽时加入有机碱，保证氨基处于自由肽。通常是在接肽时加入有机碱，保证氨基处于自由肽。