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龟板固本方对肺癌骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响张广丽黎壮伟宋 卉(广东食品药品职业学院广东 广州)摘要 目目的的 研究龟板固本方对肺癌骨髓抑制小鼠骨髓细胞 周期和凋亡相关蛋白的影响探讨其促进骨髓抑制肺癌小鼠造血功能恢复的分子机制 方方法法将 只/小鼠随机分为空白组、模型组、龟板固本方组、粒细胞刺激因子组每组 只 除空白组外其他 组接种 肺癌细胞建立肺癌模型然后腹腔注射环磷酰胺制备肺癌骨髓抑制模型 造模完成后 开始给药龟板固本方组给予龟板固本方悬液.灌胃空白组和模型组给等量生理盐水灌胃粒细胞刺激因子组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液/均 次/连续 处死小鼠采用流式细胞仪检测骨髓细胞周期免疫组化法检测细胞凋亡相关蛋白 和 表达情况结结果果 与模型组比较龟板固本方组和粒细胞刺激因子组/期细胞比例和骨髓细胞中 蛋白表达量均明显降低(均.)期细胞比例、/期细胞比例和骨髓细胞中 蛋白表达量均明显升高(均.)与粒细胞刺激因子组比较龟板固本方组 期细胞比例和骨髓细胞中 蛋白表达量均较低(均.)结结论论 龟板固本方可通过上调骨髓细胞中 蛋白表达和下调 蛋白表达抑制骨髓细胞凋亡使骨髓细胞进入 期和/增殖周期促进骨髓细胞增殖从而改善骨髓抑制关键词 龟板固本方骨髓抑制肺癌细胞周期凋亡蛋白:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 张广丽女博士主治医师研究方向为恶性肿瘤实验研究通信作者 黎壮伟 :.基金项目 广东省中医药管理局课题()广东食品药品职业学院校级课题()():()./././(.)/现代中西医结合杂志 ()(.)(次/本实验过程遵循 年国家科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见的规定 细胞株及药品 肺癌瘤株购于中国科学院上海生命科学生物化学与细胞生物学研究所 龟板固本方由龟板 、黄精 、桑椹 、黄芪、红参 组成中药饮片购自广州致信药业股份有限公司按常规方法水煎取汁浓缩实验用药生药含量为./置冰箱 保存备用 注射用环磷酰胺由江苏盛迪医药有限公司生产国药准字规格:./瓶 重组人粒细胞刺激因子注射液杭州九源基因工程有限公司生产国药准字 规格:/支 主要试剂与仪器 、抗体(英国 公司)碘化丙啶(北京百奥莱博科技有限公司)酶(公司)培养液(公司批号:)培养箱(美国 公司)全自动立式电热压力蒸汽灭菌器()型紫外分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)荧光显微镜(德国)流式细胞仪(美国 公司)实验方法将 只小鼠随机分为空白组、模型组、龟板固本方组、粒细胞刺激因子组每组 只 除空白组外其他 组小鼠均进行肺癌骨髓抑制造模 具体方法:取对数生长期的 肺癌细胞常规离心制成瘤细胞混悬液消毒小鼠右前腋取.接种于皮下 待瘤体生长至直径.时处死小鼠选取生长良好的瘤组织剪碎、称重用细胞匀浆器制成匀浆制备成浓度为 /瘤细胞混悬液每只小鼠右腋下接种.约()瘤细胞接种 后以小鼠右腋下皮下可触及肿瘤块标志肺癌造模成功 然后对肺癌造模成功小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺 /(于临用前配制)以外周血、明显低于正常小鼠提示肺癌骨髓抑制模型复制成功 造模完成后 龟板固本方组按./的剂量灌胃龟板固本方悬液空白组和模型组灌胃等量生理盐水粒细胞刺激因子组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液 /均 次/连续干预 检测指标及方法 骨髓细胞周期最后 次干预 后经颈椎脱臼处死各组小鼠取左侧股骨用剪刀剪开股骨两头露出骨髓腔然后用消毒过的注射器(号针头)吸取 培养液反复冲洗骨髓腔收集骨髓细胞全部置离心管内反复吹打使细胞完全分散然后/离心 去上清加入适量培养现代中西医结合杂志 ()液充分混匀制成骨髓有核细胞悬液 加入 冰浴预冷 乙醇中轻轻吹打混匀 固定 用 漂洗 次后加 混匀加入浓度为/的碘化丙啶染色液 避光温浴 避光存放 流式细胞仪检测各组小鼠骨髓细胞周期 细胞凋亡相关蛋白表达情况取各组小鼠右侧股骨多聚甲醛固定 脱钙常规脱水、透明、浸蜡、切片用免疫组化 法检测凋亡相关蛋白 和 表达情况 摄像显微镜下观察 和 阳性表达为细胞质呈棕黄色无棕黄色为阴性表达 每张切片随机选取 个视野计数每个视野阳性细胞数取其平均值为每张切片阳性细胞数 和 表达情况以阳性细胞所占比例和染色强度进行测定阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数 为 分 为 分 为 分 为 分 染色强度:无色 分浅黄色 分棕黄色 分棕褐色 分 以两项评分的乘积作为最终的判断结果 分为阴性 分为阳性 统计学方法采用 .统计软件进行数据分析正态分布计量数据以均数 标准差()表示多组差异比较采用单因素方差分析两两比较采用最小显著差异 检验.为差异有统计学意义 结 果 各组小鼠骨髓细胞周期比较 与空白组比较模型组/期和 期细胞比例明显升高(均.)/期细胞比例明显降低(.)与模型组比较龟板固本方组和粒细胞刺激因子组/期细胞比例均明显降低(均 .)期和/期细胞比例均明显升高(均 .)与粒细胞刺激因子组比较龟板固本方组 期细胞比例较低(.)见表 各组小鼠骨髓细胞凋亡蛋白表达情况比较与空白组比较模型组 蛋白表达量明显升高()蛋白表达量明显降低(.)与模型组比较龟板固本方组和粒细胞刺激因子组 蛋白表达量均明显降低(均 .)蛋白表达量均明显升高(均.)与粒细胞刺激因子组比较龟板固本方组 蛋白表达量较低(.)见表 表 空白组和肺癌骨髓抑制各组小鼠骨髓细胞周期比较()组别只数/空白组.模型组.龟板固本方组.粒细胞刺激因子组.注:与空白组比较.与模型组比较 .与粒细胞刺激因子组比较.表 空白组和肺癌骨髓抑制各组小鼠骨髓细胞中凋亡蛋白、表达量比较()组别只数 空白组.模型组.龟板固本方组.粒细胞刺激因子组.注:与空白组比较.与模型组比较 .与粒细胞刺激因子组比较.讨 论骨髓抑制是肺癌药物治疗过程中常见的不良反应目前仍没有非常有效的预防方法主要是骨髓抑制发生后采用促红细胞生成素、重组人粒细胞刺激因子、白细胞介素 等选择性作用于造血祖细胞促进其增殖、分化改善骨髓抑制但其作用时间比较短暂不能长期有效解决骨髓抑制问题 细胞周期包括 合成前期(期)、合成期(期)与合成后期(期)、细胞分裂期(期)骨髓细胞周期的分布情况是骨髓造血功能的重要指标可以反映骨髓增殖的状态 当化疗使造血细胞 受到损伤后骨髓细胞周期阻滞于 期来修复损伤的 对不能修复者启动凋亡程序消除受损细胞 因此解除骨髓细胞 期阻滞使细胞由期转入 期进而使 期向/期转化是拮抗放、化疗药物造成骨髓抑制的一个重要机制 造血干细胞数量减少与骨髓细胞凋亡增加有关细胞凋亡受到一系列相关基因的调节和控制其中 蛋白家族为细胞凋亡的主要调节者按其作用不同分为抗凋亡和促凋亡两大类 属于抗细胞凋亡因子其表达增强可抑制骨髓细胞凋亡 属于促细胞凋亡因子其表达增强可促进细胞凋亡 有研究表明中药具有干预细胞增殖促进细胞凋亡的作用例如青藤碱可抑制 细现代中西医结合杂志 ()胞增殖诱导细胞周期/期阻滞调节 细胞中 的表达水平诱导凋亡相关蛋白 和 表达上调促进细胞凋亡 中药复方益髓理血饮能下调骨髓增生异常综合征大鼠 表达上调 表达减少骨髓细胞凋亡骨髓抑制表现为血液不足或血液的濡养功能减退患者可见精神疲倦、乏力、头晕、面色苍白或萎黄、唇甲苍白、气促、心悸、失眠、多梦、手脚麻木舌质淡脉细无力中医可按“血虚证”进行辨证论治中医认为 脾和肾与血的生成关系最为密切血液来源于经中焦脾胃所化生的水谷精微如灵枢决气所说:“中焦受气取汁变化而赤是谓血”肾者主水受五脏六腑之精而藏之精能生血 诸病源候论指出:“肾藏精精者血之所成也”范先基等研究表明健脾益肾补血法能够明显改善肺癌化疗者骨髓造血功能提高外周血白细胞计数、中性粒细胞计数、红细胞计数、血小板计数及血红蛋白等 刘杰等研究显示健脾益肾颗粒不但能促进骨髓有核细胞分裂保护造血干细胞而且能通过提高细胞免疫功能补充营养物质和微量元素等多种途径而发挥生血作用 马晶洁等研究结果显示化疗期间配合使用健脾补肾方可改善贫血提高患者的生活质量 由此可见健脾补肾是治疗骨髓抑制的主要原则 龟板固本方具有健脾补肾、填精益髓的功效 前期动物实验证实龟板固本方能明显提升肺癌骨髓抑制小鼠外周血白细胞、血小板和红细胞计数能提高骨髓造血微环境的促红细胞生成素、血小板生成素、粒细胞集落刺激因子含量从而改善骨髓抑制促进骨髓细胞分化增殖本实验结果显示与空白组比较模型组/期和 期细胞比例显著升高/期细胞比例显著降低表明化疗不仅引起 期阻滞而且还造成 期阻滞与模型组比较龟板固本方组/期细胞比例显著下降 期和/期细胞比例显著升高表明龟板固本方可能通过解除细胞/期和 期阻滞促使 期细胞进入 期使 期细胞向/期细胞转化从而促进骨髓细胞增殖改善骨髓抑制 同时模型组 蛋白表达升高 蛋白表达降低提示化疗促进骨髓细胞凋亡龟板固本方组 蛋白表达上调 蛋白表达下调说明龟板固本方可调控凋亡相关蛋白的表达从而抑制骨髓细胞凋亡本实验在以往临床和实验研究的基础上进一步证实龟板固本方可通过上调 蛋白表达和下调 蛋白表达抑制肺癌骨髓抑制小鼠骨髓细胞凋亡促进骨髓细胞增殖为龟板固本方治疗骨髓抑制提供了实验依据利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 弥艾莉杨雪朱新勤等.恶性肿瘤化疗过程中骨髓造血功能的监测.现代检验医学杂志():.黎壮伟.补肾益髓法治疗肿瘤相关性贫血 例临床观察.湖南中医杂志():.黎壮伟.健脾补肾益髓法拮抗肺癌化疗骨髓抑制的疗效观察.湖北中医杂志():.():.:.():.:.():.任玉伟宿华威.基因家族研究进展.大连医科大学学报():.():.祝晓玲祝彼得.造血细胞凋亡研究进展.医学综述():.谢程国马胜利张镜伟.青藤碱对肾癌细胞 细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.广州医药():.黄玉静熊德上徐酉华等.益髓理血饮减少二甲基苯蒽诱导的骨髓增生异常综合征大鼠骨髓细胞凋亡.中南大学学报(医学版)():.范先基冯献斌宁雪坚等.健脾益肾补血法改善肺癌化疗患者骨髓造血功能的观察与分析.中医药导报():.刘杰侯丽陈信义.健脾益肾颗粒治疗肺癌化疗相关性贫血的临床研究.中医药学刊():.马晶洁苗振静马旭辉等.健脾补肾方联合化疗治疗非小细胞肺癌 例.中医研究():.黎壮伟张广丽.龟板固本方对肺癌骨髓抑制小鼠骨髓造血微环境的影响.中医肿瘤学杂志():.收稿日期 现代中西医结合杂志 ()