核酸检测实验室建立与应用.ppt

核酸检测实验室建立与应用卫生部临检中心深圳市血液中心血液病毒核酸检测联合实验室叶贤林4/21/20241.核酸扩增检测实验室的建立n人员n场地n检测方法选择n实施方案依据：卫生部颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号）4/21/20242.核酸实验室人员要求n资质:经过临检中心PCR培训班培训并取得上岗证；通过血站核酸实验室岗前培训考试合格。n培训:无”核酸”的概念形成,防污染的概念良好工作习惯的培养.报告的正确发放.n后备人员的培养.4/21/20243.试剂试剂准准备备区区标标本制本制备备区区扩扩增区及增区及扩扩增增产产物分析区物分析区样本离心交接区报告发放区核酸实验场地4/21/20244.方法选择:TMA与PCRTMAPCR扩扩增原理增原理模模拟拟自然自然 DNA 转录转录成成 mRNA 的的过过程程模模拟拟自然自然DNA复制的复制的过过程程靶目靶目标标RNADNA酶酶MMLV逆逆转录转录酶酶及及T7 RNA聚合聚合酶酶 DNA聚合聚合酶酶反反应应体系体系两种两种酶酶，两条引物，两条引物，dNTP,NTP一种一种酶酶，一，一对对引物，引物，dNTP温度条件温度条件恒温（恒温（41.5）循循环导热环导热（变变性，退火，延伸）性，退火，延伸）扩扩增增仪仪器器水浴箱或者加水浴箱或者加热块热块热热循循环仪环仪扩扩增增产产物物RNADNA扩扩增速度增速度每个循每个循环环可以生成可以生成100-1000个复制物，个复制物，在在15-30分分钟钟内可增加内可增加10亿亿倍复制物倍复制物以以2n扩扩增，增，23 h就能将待就能将待扩扩目的基因目的基因扩扩增放大增放大10亿亿倍倍4/21/20245.TMA的优点 缺点自自动动化程度高化程度高灵敏度高灵敏度高扩扩增效率高：增效率高：10n 不能不能绝对绝对定量定量4/21/20246.PCR的优点 缺点易于自易于自动动化化灵敏度高灵敏度高 扩扩增效率高增效率高汇汇集拆分集拆分过过程繁程繁琐琐 拆分可减低非反拆分可减低非反应应性比率性比率4/21/20247.核酸核酸试剂质试剂质控控n试剂的确认 试剂运输过程的控制(温度条件时限)灵敏度的要求 内标的要求n试剂涵盖的基因型 4/21/20248.检测流程(1):常规筛查合格汇集标本检测流程4/21/20249.检测流程(2):常规筛查合格单人份标本检测流程4/21/202410.检测流程(3):平行检测流程样本清点交接核酸单份检测常规检测合格标本不合格标本阴性标本反应性标本合格标本发布结果单项目反应性无反应性 阳性或可疑结果淘汰 阳性或可疑结果淘汰4/21/202411.标准操作规程(SOP)的编写n核酸实验室设置与管理规范n核酸实验室标本检测流程n核酸实验室岗位职责n核酸实验室关键试剂管理规范n核酸实验室仪器设备管理规范n核酸实验室检测标本管理规范n核酸实验室室间质量评价规范n核酸实验室记录管理制度n核酸实验室生物防护规范n核酸反应性献血者追踪规程n核酸实验室检测应急措施4/21/202412.标准操作规程(SOP)的编写n核酸标本离心交接操作规程n核酸标本提取及汇集操作规程(科华)n核酸标本扩增检测操作规程（科华）n核酸标本全自动检测分析系统操作规程（CHIRON）n核酸标本检测报告发布操作规程（唐山软件）n核酸标本检测复检操作规程n生物安全柜标准操作规程n可移动紫外线灯标准操作规程n低温高速离心机标准操作规程nABI7300型核酸扩增荧光检测仪标准操作规程4/21/202413.核酸实验室防污污染措施染措施n主要的污染源n扩增产物n标本之间产生的气溶胶n操作人员n手n衣服4/21/202414.核酸实验室防污污染措施染措施n要有独立的空气处理系统.n各区始终处于完全分隔的状态，不能有空气的直接相通n实验室保持合理的通风n对各区内的设备、物料进行标示，专区专用；其他物品不得混用（例如：笔、纸张）n空气：试剂准备区标本制备区扩增区产物分析区n试剂阳性对照储存在标本制备区n使用带滤芯的吸头4/21/202415.核酸实验室防污污染措施染措施n使用外排式的生物安全柜n自配试剂应分装成小规格，未用完的试剂应废弃n使用次氯酸钠溶液消毒（台面、地面）n使用1mol/L的HCL溶液（吸头）n使用紫外线照射（空气和台面）n使用无水乙醇溶液（空气喷雾）4/21/202416.核酸实验室污污染后措施染后措施n实验室污染后，如何处理？n通风n次氯酸钠溶液（扩增区不宜使用）nHCL溶液（吸头）n紫外线（固定、移动）n酒精喷洒（空气）n应设计有备用实验室:如开设独立的报告发放区作为备用4/21/202417.中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核酸提取、反转录及扩增过程的效率。血血筛筛核酸核酸检测检测的内的内标标的作用的作用内标的作用质控整个反应。提示假阴性检测结果。监控反应的外部条件内标浓度要合适保持适度的内标失控.(ChiSqIntercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011应用SAS9.0软件PROBIT分析结果4/21/202421.Probit Analysis on Dose Probability Dose 95%Fiducial Limits 0.50 9.57017 5.12038 15.55110 0.55 10.63175 6.02869 17.84047 0.60 11.83113 7.02737 20.77334 0.65 13.21316 8.12392 24.64098 0.70 14.84467 9.33581 29.90750 0.75 16.83205 10.69944 37.36963 0.80 19.35973 12.28641 48.54111 0.85 22.78900 14.24179 66.74000 0.90 27.97953 16.90417 101.07479 0.91 29.40116 17.58727 111.93157 0.92 31.02755 18.34915 125.13015 0.93 32.91988 19.21204 141.54165 0.94 35.17006 20.20878 162.54851 0.95 37.92474 21.39086 190.498224/21/202422.4/21/202423.阳性献血者的追踪n沟通原则:专业授权、人性化、保密、尊敬。n沟通方式：电话、面谈n沟通技巧：表扬和鼓励、合理解释、知情、适当的问候4/21/202424.献血者核酸检测不合格解释n由于核酸由于核酸检测检测方法目前尚不能排除假阳性，方法目前尚不能排除假阳性，对对实验过实验过程要求极高，另外乙肝和丙肝病毒程要求极高，另外乙肝和丙肝病毒进进入入人体后，人体又有清除人体后，人体又有清除现现象，但血液不能用于象，但血液不能用于临临床，因此核酸床，因此核酸检测检测不合格血液不合格血液仅仅表示表示该该血液血液不能用于不能用于临临床床输输血。血。n不作不作为为献血者健康体献血者健康体检检指指标标。n更不宜作更不宜作为为疾病疾病诊疗诊疗指指标标。n献血者献血献血者献血权权利仍保留。利仍保留。4/21/202425.关于核酸检测的解释n汇集结果成反应性,拆分结果为阴性.n内标失败.nELISA(+),核酸结果为(-)nELISA(-),核酸结果为(+)n核酸单检结果反应性与血液发放.n化学发光法与核酸检测.4/21/202426.1.1.灵敏度：灵敏度：汇汇集池大小要集池大小要满满足灵敏度要求。足灵敏度要求。灵敏度太低，病毒低灵敏度太低，病毒低载载量献血者漏量献血者漏检检。HBV DNA HBV DNA 灵敏度宜灵敏度宜5050拷拷贝贝/ml./ml.2.2.引物是否有效性引物是否有效性,能否能否检测亚检测亚型和突型和突变变株感染。株感染。3.3.假阳性，防假阳性，防污污染措施（血染措施（血筛筛主要要防止主要要防止RNARNA酶酶的的污污染）。染）。4.4.核酸提取效率与自核酸提取效率与自动动化化.5.5.需要需要规规范化范化场场地和高素地和高素质质的操作人的操作人员员.6.6.参加国参加国际间际间室室间质间质控控,提高提高检测检测水准水准.血液核酸血液核酸筛查筛查注意的注意的问题问题4/21/202427.深圳血液中心核酸检测概况n对161228人份酶免疫检测结果阴性标本进行核酸检测，共检出33例不相同HBVDNA阳性献血者，总比率为1：4885。n检出anti-HCV阴性、HCVRNA阳性1例，定量结果为1.2105IU/ml。3个月后追踪结果发现anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。4/21/202428.项项目目科科华华（自（自动动化）化）科科华华（半自（半自动动化）化）美国美国罗罗氏氏上海浩源上海浩源凯凯荣荣（CHICHIRONRON）方法学方法学全自全自动动提取提取+实实时荧时荧光光PCR病毒离心富病毒离心富集集+半自半自动动提取提取+实时实时荧荧光光PCR全自全自动动提提取取+PCR-ELISA半自半自动动提提取取+PCR+毛毛细细管管电电泳分泳分离离TMA汇汇集量集量 845ul8150ul2445ul5200ul500 ul 单单人人份份检测检测数数6849637041315121412514603HBV DNA阳阳性数性数122838HBV阳性比阳性比率率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸检测概况4/21/202429.HBV DNA阳性献血者追踪情况n对17位HBVDNA阳性献血者进行了追踪，9位献血者发生血清转换现象。n4例呈窗口期特征（或部分），n2例献血者发现病毒感染后自愈现象n1例献血者原为乙肝大三阳患者，经治疗后HBsAg转阴后，献血，常规检测为合格，核酸检测HBVDNA（+），经追踪后HBsAg变为阳性4/21/202430.4/21/202431.4/21/202432.4/21/202433.4/21/202434.4/21/202435.HBV DNA检测阳性献血者追踪概况追踪时间(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18+21241504528未检出9126未检出15631未检出21429未检出4/21/202436.1号献血者在追踪时表明曾经是大三阳,治疗转阴后献血,被核酸检出阳性,7天后HBsAg检测(+).4/21/202437.4/21/202438.1.Pooling by STAR processor2.Virus enrichment by centrfugation3.Extracted by KHB-10004.Amplified and detected by ABI73004/21/202439.4/21/202440.1.pooling and extraction by STAR LET2.Amplification and detection by ABI7300Automation process4/21/202441.4/21/202442.4/21/202443.4/21/202444.MANY THANKS!nE-mail:YEXIANLIN90HOTMAIL.COM问 题?4/21/202445.谢谢大家！4/21/202446.