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食品中蛋白质的测定方法

蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。
一 凯氏定氮法
我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。
(一)、 常量凯氏定氮法
衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。
一般食品蛋白质含氮量为l6％，即1份氮素相当于6.25分蛋白质,以此为换算系数6.25，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同.如玉米、高梁、荞麦,肉与肉制品取6.25，大米取5.95、小麦粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取5.17，动物胶5.55。
测定原理：
食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。
(1) 消化反应：有机物(含C、N、H、O、P、S等元素)+H2S04 -→(NH4)2S04+C02↑+S02↑+S03+H3PO4+CO2↑
(2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH-→2NH3↑+2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3BO3-→(NH4)2B4O7+5H2O
(3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O-→2NH4CH+4H3BO3 或 (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2
试剂与仪器：
1、硫酸钾；
2、硫酸铜；
3、浓硫酸；
4、4％硼酸溶液(饱和溶液)；
5、40％氢氧化钠溶液；
6、混合指示剂：临用时把(溶解于95％乙醇的)0.l％甲基红溶液10毫升和(溶于95％乙醇的0).l％甲基蓝溶液5毫升混合而成；
7、0.1N盐酸标准溶液或0.1N硫酸标准溶液；
8、凯氏定氮仪一套。
9、定氮瓶500ml二只。
10、三角瓶250ml 3只。
11、量筒50ml、lOml、lOOml。
12、吸管10ml。
13、酸式滴定管1支,规格25ml。
14、小漏斗1只。

操作方法：
1、样品消化：精密称取0.200-2.00g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加100ml水，放冷。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸，用同一方法做试剂空白试验。
2、蒸馏、吸收：按图装好定氮装置。接收瓶内加入50ml 4%硼酸溶液及混合指示剂5滴，并使冷凝管的下端插入液面下；将70ml 40%氢氧化钠溶液慢慢通过安全漏斗进入蒸馏烧瓶中，用直火加热蒸馏30分钟，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。(接收瓶内的溶液呈蓝色)。
3、滴定：以0.1N盐酸标准溶液定至溶液灰色或淡紫色为终点。同时作一试剂空白测定除不加样品外，丛消化开始操作完全相同。
计算：
蛋白质(%)=（(V1-V2)×N×0.014×F）×100/ m 　

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。
注：
（1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。

（4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。
（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
（8）氨是否完全蒸馏出来，可用精密PH试纸试馏出液是否为碱性。
（9）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（10）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++
下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:
（1）K氏烧瓶和取样量
如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
（2）分解剂
A H2SO4和K2SO4的添加量
有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：
1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml
这种比例在国内外都使用，是公认的
还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml
B 催化剂
用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。
（3）热源的强度
消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。
（4）氨的蒸馏和吸收及滴定
蒸馏有两种:
1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）
2 水蒸汽蒸馏
蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。
吸收液有：
1标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂
2 硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂
目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。
〈6〉注意事项
a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。
b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。
c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。
d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。
f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。
h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。
2 K氏微量定氮仪法
3 K氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)
操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。

计算总氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100
对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。
4 K氏自动定氮法
原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。
二 水扬酸比色法
1 原理： 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。
2 方法 （１）标准曲线的绘制
取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6
分别加空白酸液 2ml
分别加磷酸盐缓冲液 5ml
稀释至总体体积至15ml
分别加水扬酸钠 5ml
37C水浴 15分钟
加入次氯酸钠 2.5ml
37C水浴 15分钟
取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。
（2）样品处理：
准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大
火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量
瓶。
（3）样品测定：
准确吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→准确吸2ml→于25ml容量瓶中→加
5ml磷酸缓冲液→以下操作与标准曲线绘制的步骤相同
并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。
（4）计算
                   C×F
含氮%= ---------------------------× 100
               W×1000×1000
C---从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）
F---样品溶液的稀释倍数
W---样品重量（g）
蛋白质%=总氮%×K（K可为6.25，也可查）
3注意事项：
A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。

B 当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度
C 这种方法测定结果基本与K氏法一致。
4 试剂
（1）氯标液：称经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g→于烧瓶中定容10ml→此液1ml相当于
1.0mg氮标液→使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。
（2）空白酸液：称0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化剂→与样品一样消化→定容250ml→
使用时吸收此液10ml→加水至100ml为工作液备用。
（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠→加38g磷酸三钠→加20g三九石酸钾钠→加400ml水
溶解→过滤→另称35gNaOH溶于100ml水中→冷至室温→缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中→加
入水稀释至1000ml备用。
（4）水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释
至500ml
（5）次氯酸钠溶液：吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml
5 仪器
（1）分光光度计
（2）恒温水浴
三 紫外分光光度法
1 原理：
pro及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与pro浓度（3~8mg/ml）成直线关系，因此，通过测定pro溶液的吸光度，并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。
2 试剂：
（1） 0.1mol/l柠檬酸水溶液。
（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。 脲的2N氢氧化钠液
（3） 95%乙醇
（4） 无水乙醚
3 仪器
（1）751型的紫外分光光度计
（2）离心机
4 操作方法
（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml烧瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟3000~5000转的速度离心10分钟，分别吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）
以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）样品测定
准确称取试样1.00g→于50ml烧杯中→加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml→搅拌10分钟→四层纱布过滤到离心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出pro的含量。
计算： 蛋白质= C/W×　100　　
C----从标准曲线上查得的pro含量（mg）
W----测定样品溶液相当于样品量（mg）
说明：
a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性pro样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。
b.温度对pro水解有影响，操作温度应控制在20~30℃。
四 双缩脲法-皮尼克法
1 原理：
双缩脲在碱性条件中，能与CuSO4结合成红紫色的络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。
2 试剂
⑴甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。
⑵酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。
配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。
3 方法：样品测定
标准曲线绘制
准确称0.6g样品→使用试剂（1）
准确称0.5g样品→使用试剂（2）
假如用试剂（2）
（1）准确称样→0.5g→于80ml离心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定剂→盖上盖子离心10min（4000转/分）→放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm处测定吸光度，从标准曲线上查出pro含量。
（2）标准曲线绘制
按样品测定方法，根据样品中pro含量，取离心澄清样液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中→分别加水定容，按照样品测定其吸光度。
事先用K氏定氮法测定样品中pro含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
4 计算：蛋白质%=C/W×100
C----从标准曲线上查得得pro含量（mg）
W----测定样液时相当于样品重量（mg）