组织学技术.pptx

组织学技术HEHE染色，脑垂体染色，脑垂体扫描电镜术扫描电镜术(scanning(scanning electron microscopy,SEM):electron microscopy,SEM):观察组织细胞表面结构观察组织细胞表面结构电镜技术电镜技术透射电镜术透射电镜术(transmission(transmission electron microscopy,TEM):electron microscopy,TEM):观察细胞内部结构观察细胞内部结构Transmission Electron Microscope浆细胞浆细胞血细胞血细胞组织化学技术组织化学技术 一般组织化学一般组织化学 (Classical histochemistry)(Classical histochemistry)免疫组织化学免疫组织化学 (immunohistochemistry)(immunohistochemistry)原位杂交原位杂交 (in situin situ hybridization)hybridization)兔肝兔肝PAS反应反应图像分析术图像分析术-形态计量术形态计量术 应用数学或统计学原理对组织切应用数学或统计学原理对组织切片提供得平面图像进行分析片提供得平面图像进行分析,从而获从而获得立体得组织和细胞内各种有形成分得立体得组织和细胞内各种有形成分得数量、体积、表面积等参数得数量、体积、表面积等参数,从量从量得角度显示结构和功能得关系。得角度显示结构和功能得关系。细胞培养术和组织工程细胞培养术和组织工程细胞培养术细胞培养术:把从机体取得得细胞把从机体取得得细胞在体外模拟体内得条件下进行培在体外模拟体内得条件下进行培养得技术。养得技术。组织工程组织工程:细胞培养术在体外模拟细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官得技术。构建机体组织或器官得技术。实验中的组织工程耳实验中的组织工程耳石蜡切片得制备石蜡切片得制备基本操作步骤基本操作步骤 取材、固定取材、固定 洗涤、脱水洗涤、脱水 透透 明明 浸蜡、包埋浸蜡、包埋 切切 片片 染染 色色 脱水、透明、封片脱水、透明、封片 大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点一、取材、固定一、取材、固定 1、动物致死法 v 麻醉麻醉v 空气栓塞空气栓塞v 颈椎脱臼或断头颈椎脱臼或断头v 股动脉放血股动脉放血(一一)取材取材 2、动物选择根据教学或科研目得和要求确定根据教学或科研目得和要求确定。3、取材方法取材顺序取材顺序 先腹腔先腹腔,后胸腔、后胸腔、盆腔盆腔,最后取神经系统最后取神经系统肌组织肌组织:纵切后结扎固定纵切后结扎固定,以防因以防因收缩而出现波浪形变化。取纵、收缩而出现波浪形变化。取纵、横切面横切面;肝脏肝脏:右前叶或左外叶中部。纵右前叶或左外叶中部。纵切或冠状切面切或冠状切面;胆囊胆囊:取胆囊体部取胆囊体部,附于滤纸附于滤纸,洗洗去胆汁后固定去胆汁后固定;组织、器官取材举例组织、器官取材举例胰腺胰腺:取含有较多胰岛得胰尾部。取含有较多胰岛得胰尾部。胃胃:取胃底或胃体。附于滤纸取胃底或胃体。附于滤纸,防止防止卷缩卷缩;肾脏肾脏:纵剖纵剖,再做扇形切面再做扇形切面,皮、髓皮、髓质均有。质均有。4、外科活体组织取材q临床手术取材临床手术取材:多用于肿瘤组多用于肿瘤组织。包括肿瘤及其周围组织织。包括肿瘤及其周围组织;q活体小组织活体小组织:包埋时注意切片包埋时注意切片得面得面,因体积较小因体积较小,仔细操作仔细操作5、取材注意事项 动作轻、快动作轻、快,保证组织新鲜保证组织新鲜;保持组织清洁保持组织清洁;力求组织块小而薄力求组织块小而薄;一刀切取一刀切取,避免挤压避免挤压;尽量保持组织原有形状尽量保持组织原有形状;部位准确部位准确,切面合适切面合适;切除不需要得部分切除不需要得部分(二二)固定固定 1、意义和目得 使要观察得组织结构尽量接近于生前使要观察得组织结构尽量接近于生前得正常状态。得正常状态。防止组织细胞死后得变化和自溶防止组织细胞死后得变化和自溶;使细胞内得可溶成分转变为不溶性物质使细胞内得可溶成分转变为不溶性物质;使细胞内成分沉淀、凝固后产生不同得使细胞内成分沉淀凝固后产生不同得 折射率和对染料得亲和力折射率和对染料得亲和力;增加组织硬度增加组织硬度,利于切片利于切片;防止组织过度收缩或膨胀防止组织过度收缩或膨胀 2、注意事项 p动作迅速动作迅速,保持组织新鲜保持组织新鲜;p防止组织因固定而发生变形防止组织因固定而发生变形;p使用新配制得固定剂使用新配制得固定剂;p固定剂得用量固定剂得用量:组织块体积得组织块体积得10-10-1515倍倍;p固定得时间依组织得种类、性质、固定得时间依组织得种类、性质、大小、固定剂得种类、性质、渗大小、固定剂得种类、性质、渗透力而定透力而定;p固定过程中时常摇动固定过程中时常摇动;p作好记录作好记录,组织名称、固定液、时组织名称、固定液、时间等间等3、固定液得种类 单纯固定液单纯固定液 甲醛、乙醇、苦味酸、丙酮、甲醛、乙醇、苦味酸、丙酮、氯化汞、等氯化汞、等 混合固定液混合固定液 CarnoyCarnoy液、液、BouinBouin液、液、ZenkerZenker液等液等 4、固定得方式 特殊固定法特殊固定法 灌注固定灌注固定蒸气固定蒸气固定常规固定法常规固定法二、二、洗涤、脱水、透明、浸蜡、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋包埋（一）洗涤（一）洗涤 目的目的 停止固定液对组织的作用，停止固定液对组织的作用，利于脱水、切片和染色。利于脱水、切片和染色。方法方法固定液以水配制者固定液以水配制者流水冲洗流水冲洗;固定剂含乙醇者固定剂含乙醇者不冲洗不冲洗,或用与或用与固定剂中乙醇浓度相近得乙醇冲洗固定剂中乙醇浓度相近得乙醇冲洗;特殊固定液洗涤法特殊固定液洗涤法(二二)脱水脱水目得和原则目得和原则 用某些溶剂逐步将组织用某些溶剂逐步将组织块吸收得水分置换出来块吸收得水分置换出来,以利于透明剂和石蜡或以利于透明剂和石蜡或火棉胶得渗入。火棉胶得渗入。种类和效果种类和效果 非石蜡溶剂得脱水剂非石蜡溶剂得脱水剂:乙醇、丙酮等乙醇、丙酮等脱水兼石蜡溶剂得脱水剂脱水兼石蜡溶剂得脱水剂:正丁醇和环正丁醇和环氧六烷等氧六烷等(三三)透明透明目得目得 便于透蜡包埋。大多数脱水便于透蜡包埋。大多数脱水剂与石蜡不相混合剂与石蜡不相混合,通过透明通过透明剂得作用才能透蜡。剂得作用才能透蜡。种类种类 二甲苯、苯、甲苯、氯仿等二甲苯、苯、甲苯、氯仿等。(四四)浸蜡浸蜡(透蜡透蜡)目得和方法目得和方法 脱水、透明后得组织脱水、透明后得组织用石蜡、火棉胶、明胶等支持剂透用石蜡、火棉胶、明胶等支持剂透入其内部入其内部,替代组织中得透明剂替代组织中得透明剂,并并渗入组织内部使软组织变为适当硬渗入组织内部使软组织变为适当硬度得蜡块度得蜡块,以利于切片和观察。以利于切片和观察。浸蜡剂得种类浸蜡剂得种类 石蜡、火棉胶、明石蜡、火棉胶、明胶等胶等 (五五)包埋包埋1、石蜡包埋法常用得方法浸蜡浸蜡软蜡软蜡I软蜡软蜡II硬蜡硬蜡54-56 5658 2、快速石蜡包埋法用于快速诊断包埋过程包埋过程包埋注意事项包埋注意事项3、火棉胶包埋法用于大块组织和眼球4、碳蜡包埋法、明胶包埋法不常用三、组织制片法三、组织制片法-切片切片(一一)石蜡切片法石蜡切片法 1、切片前得准备工作 载波片得处理载波片得处理;防脱片剂得选择防脱片剂得选择;修块修块;备刀备刀 2、切片过程 3、石蜡切片常遇到得问题及解决得方法 4、切片注意事项 (二二)冰冻切片法冰冻切片法 1、制备石蜡切片得基本步骤。、制备石蜡切片得基本步骤。2、组织取材和固定得注意事、组织取材和固定得注意事项。项。思考四、染四、染 色色 将染料配成溶液将染料配成溶液,将组织切片浸将组织切片浸入染色剂中入染色剂中,使组织、细胞等成分被使组织、细胞等成分被染上深浅不同得颜色染上深浅不同得颜色,产生不同得折产生不同得折光率光率,便于在光镜下观察。便于在光镜下观察。1 1、目、目得得2 2、染料特性、染料特性 染料就是有机化合物染料就是有机化合物,在其分子在其分子结构中有特殊功能得基团结构中有特殊功能得基团,发色团发色团和助色团。和助色团。3.3.染色原理染色原理尚不完全清楚。尚不完全清楚。化学反应；化学反应；物理作用：吸附作用、吸收作用物理作用：吸附作用、吸收作用 4 4、常规染色技术、常规染色技术HEHE染染色色 苏木精苏木精(Hematoxylin)(Hematoxylin)为碱性染为碱性染料料,能将细胞核染成蓝色能将细胞核染成蓝色;伊红伊红(Eosin)(Eosin)为酸性染料为酸性染料,常将细常将细胞质染成红色胞质染成红色