分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版).doc

分子克隆技术实验讲义
黑龙江大学生命科学学院
2016年3月
甜菜M14品系BvM14-glyI基因得克隆与鉴定
一、实验目得
1、熟悉与了解目得基因克隆与鉴定得过程与方法。
2、学习与掌握质粒、T载体得特点。
3、学习与掌握TA克隆得连接体系及操作要点。
4、学习与掌握XcmⅠ酶切制备T载体得过程及方法。
5、学习与掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞得原理与方法。
6、学习并掌握热激法转化技术得原理与操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定与筛选得原理及蓝白筛选得原理与方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA得原理及操作步骤。
二、相关知识
(一)T载体得制备
pMD18-T Vector就是一种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)得商业化专用载体,由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处得XbaⅠ与SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点,用EcoRⅤ进行酶切反应后,再左两侧得3′端添加“T”而成,可以大大提高PCR产物得连接、克隆效率。
相关知识点:(1)质粒得提取;(2)酶切;(3)PCR等。
(二)DNA得重组与连接(PCR产物得克隆)
把DNA片段从某一类型得载体无性繁殖到另一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。所谓重组,就就是把外源目得基因“装进”载体得过程,即DNA得重新组合。为了将目得基因重组于载体分子中,需要将载体DNA与目得基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接得线性分子,使其与相同酶切过得载体分子相互连接,彼此成为配伍末端(patible end),以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段得专用载体,如专门用于克隆PCR产物得载体,大大方便了实验操作。
相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2)DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶得分类及功能等。
(三)大肠杆菌感受态细胞得制备
外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后,需将其导入受体细胞进行扩增与筛选,得到大量、单一得重组体分子,这就就是外源基因得无性繁殖,或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞,大肠杆菌宿主菌就是目前基因工程最常用得受体细胞。感受态细胞(petent cell)就是经过一定方法处理后,具有接受外源DNA能力得大肠杆菌,只有发展了感受态得细胞才能稳定地摄取外来得DNA分子。
相关知识点:(1)克隆;(2)宿主细胞得定义及分类;(3)感受态细胞定义及其功能;(4)转化定义及方法(DMSO、MnCl2、TB aq、PEG)等。
(四)重组DNA得转化及重组子得鉴定
将外源DNA分子导入某一宿主细胞得过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目得,一就是大量产生重组DNA分子,在完成连接反应后,重组DNA分子往往只有纳克级得量,不易操作与进行下一步得分析,若把重组DNA分子导入到细菌细胞中,细菌细胞可分裂多次产生克隆,克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝得重组DNA分子,这样重组DNA分子得量就多了;二就是对重组DNA分子进行纯化,在构建重组DNA分子得过程中很难保证体系中不污染其她得DNA分子,连接过程完成以后体系中有多种分子存在,除了需要得重组DNA分子以外,还含有没有连接上得载体分子、没有连接上得DNA片段、自身环化得DNA分子与连接上污染DNA片段得重组DNA分子,未连接上得载体与DNA片段对实验影响不大,因为它们即使导入细菌细胞,因为不能复制,很快就要被细菌细胞中得酶降解掉;对克隆工作带来影响得就是后两种分子,因为它们都为环状,在细菌细胞中都能复制,因而都能产生克隆,但就是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子,每个单克隆都就是由一个细胞形成得,因此在每个克隆中所有得细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同得克隆进行筛选,就可以鉴定所需得重组DNA分子。
所谓得重组子(rebinant)也叫做转化子(transformant)就是指吸收了重组DNA分子得转化细胞。将重组子从其它细胞群中(如上面提到得对克隆影响较大得自身环化得DNA分子与连接上污染DNA片段)分离出来,并鉴定无性繁殖得外源基因确实为目得基因,这过程称为筛选(screening)。根据载体体系、宿主细胞得特性以及外源基因在受体细胞表达情况得不同,初步把筛选方法分为直接筛选与间接筛选,直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法;间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法;本试验采用平板筛选法中得蓝白筛选法。
相关知识点:
①转化(transformation) 质粒(plasmid)
②转染 (transinjection) 噬菌体(phage)
③显影注射
(1)导入得方法 ④电转化 2、5kv
⑤基因枪 geneblaster
⑥脂质体介导法
⑦其它方法:快速冷冻法、碳化硅纤维介导法
(2)重组子: 转化子
(3)重组反应体系中得成分:①②③④⑤⑥
(4)筛选得方法
DNA鉴定筛选法:定位、测序
①直接筛选法 选择性载体筛选法:λph包裹、抗药性 α-互补
分子杂交筛选法:ISH、Southern Blot
免疫化学
免疫学方法
②间接筛选法 酶免疫检测
mRNA翻译检测法
(五)质粒DNA得提取(碱裂解法)
原核生物没有真正得细胞核,DNA一般位于一个类似“核”得结构——称为类核体上(因为不就是一个完整得细胞核)。E、coli得遗传物质主要就是染色体DNA ,E、coli得染色体为双股环状DNA,含有1 400个以上得基因,另外还有一些质粒DNA。
1、质粒得概念
质粒就是细菌(如E、coli)染色体外得小型环状双链DNA分子。一般说来,质粒不就是细菌生长繁殖所必须得结构,就细胞生存而言,质粒就是可有可无得。质粒分子本身含有复制功能得遗传结构,故能在细菌内独立地进行复制,并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒得意义
(1)质粒作为一种裸露得,比病毒更简单、更有自主复制能力得DNA分子,正好处于生命与非生命得分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息,说明质粒就是独立得有机体,就是亚细胞生命体系得成员,就是比病毒更简单得原始生命形态,所以质粒就是研究生命起源得一块重要得基石。
(2)要把一个有用得基因通过基因工程手段送进生物细胞中,需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞得这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递与遗传交换得能力,因此,质粒作为基因工程得重要运载工具,在现代分子生物学占有重要地位。
3、质粒得分类
不同得质粒在宿主细胞中得拷数也不同,根据质粒在细胞中拷贝数得多少,Rownd(1969)把质粒分为严密型质粒与松弛型质粒。
(1)严密型质粒(stringent plasmid):严密型质粒多半就是一些具有自身传递能力得大质粒,其DNA得复制与宿主染色体DNA得复制相偶联,受到某种程度得控制,每个细胞仅有1-2个拷贝。
(2)松驰型质粒(relaxed plasmid):松驰型质粒多半就是分子量较小、不具传递能力得质粒,其复制就是在松驰控制下进行得,每个细胞得拷贝数约为10～200个。当向培养基中加入氯霉素时,细胞得蛋白质合成被抑制,细胞染色体DNA与严密型质粒DNA得复制停止,松驰型质粒DNA得复制继续进行。松驰型质粒DNA得拷贝数可达数百个,基因工程中使用得质粒都就是松弛型质粒。
相关知识点:
(1)质粒得分类:
①与宿主相关程度:严密型质粒(stringent plasmid)、松弛型质粒(relaxed)
②就是否有转移基因:接合型质粒、非接合型质粒
③带有特殊用途得基因:生殖质粒(F质粒)、抗性质粒(R-质粒)、col质粒(编码杀死其她细菌得蛋白质)、降解质粒、致病质粒(Ti)
OC
L
SC
(2)质粒得提取方法:煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法;
(3)质粒得构型:
①SC构型:cccDNA (covalently closed circle DNA)
②OC构型:ocDNA (open circle DNA)
③L构型:L-DNA (linearDNA)
三、实验原理
(一)T载体得制备

XcmⅠ就是一种Ⅲ型得限制性核酸内切酶,其识别序列为:
5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′
3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5
其中阴影部分为XcmⅠ得识别序列,“^”为XcmⅠ得切割位点,其识别序列中间得9个任意核苷酸(N)对XcmⅠ得酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均就是T得载体,本实验利用了XcmⅠ得识别序列得特点,引物得3′端带有XcmⅠ酶切位点,其序列如下:
Primer1:5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT- 3′
Primer2:3′- TCTCTAAGGTATGC^ATATGACCCGC 5′
引物中“^”为XcmⅠ得切割位点,当XcmⅠ对PCR得到得线性片段进行酶切得时候,便会产生一个与T载体形式完全一样得3′-T粘性末端。
(二)DNA得重组与连接(PCR产物得克隆)
1988年,Clarke发现所有得PCR产物都在Taq DNA聚合酶得作用下在3′端附加上了一个3′突出得腺苷酸,因为Taq DNA聚合酶具有非模板介导得核苷酸转移酶活性,可在双链DNA末端加上一个单一得3′突出得dATP,利用Taq DNA聚合酶得这一特性,在克隆载体上附加3′胸腺嘧啶(dTTP)形成T-A克隆系统,即可直接对PCR产物进行有效得克隆,这样得载体称为T-载体。
(三)大肠杆菌感受态细胞得制备
大肠杆菌感受态细胞得制备技术就是从20世纪70年代初期发展起来得,当时人们发现如果把E、coli细胞浸在一冰冷得盐溶液,它吸收DNA分子得能力要比不浸得细胞强;经过摸索与总结,人们终于采用50 mmol/L得氯化钙(CaCl2)溶液来制备感受态细胞。其她得盐(如氯化铷RbCl)也很有效。尽管对这一处理得确切机制仍不清楚,但有人对感受态提出了两种假说,一种认为就是细菌细胞壁得局部失去了壁结构或局部溶解,让外源DNA分子通过质膜进入;另一种认为DNA分子能进入细菌细胞就是由于细胞处于感受态时表面形成了一种可接受DNA得酶位点。一旦细胞被处理制备成感受态细胞,它们就能稳定地摄取外源DNA分子了。
(四)重组DNA得转化及重组子得鉴定
转化就是使重组体DNA分子在热休克得短暂时间内被导入受体。一般认为DNA分子在转化过程中将经历四个阶段,第一个阶段就是吸附阶段,完整得双链DNA分子将吸附于感受态细胞得表面;第二个阶段为转入阶段,双链DNA分子解链,以单链得形式进入细胞,而另一链则被降解;第三阶段就是自身稳定阶段,外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA;第四个阶段就是表达阶段,即目得基因随同质粒得复制子一起复制。
有些株系得E、coli尽管用抗生素抗性基因得插入失活法来筛选重组子很方便,但有得质粒还就是采用了其她基因进行筛选,效果同样不错。以pΜC 8载体为例,它除了含有氨苄青霉抗性基因以外,还含有一个称为LacZˊ得基因。该基因编码β-半乳糖苷酶得一部分。半乳糖苷酶参与得将乳糖分解成葡萄糖与半乳糖得生化过程,本来就是由E、coli染色体上得LacZ基因编码。有些株系得E、coli带有修饰过得LacZ 基因(即缺少LacZˊ得LacZ基因),只编码β-半乳糖苷酶得α-肽。这些株系得E、coli细胞只在有吸收了像pΜC 8这样带有LacZˊ基因得质粒分子得情况下才能够合成完整得β-半乳糖苷酶。因此在筛选pΜC 8得重组子时,先将转化子涂布于含有氨苄霉素得培养基上培养,然后再通过检测β-半乳糖苷酶得活性来选择重组子,既能抗氨苄霉素,又能合成β-半乳糖苷酶得细胞就就是重组子细胞。现代化学得发展给我们提供了非常直接地检测β-半乳糖苷酶活性得方法,这种方法涉及一种乳糖得类似物——5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chLoro-3-indoLyL-β-D-galactopyranoside),因为它得英文名太长,所以人们就用X-gal来代替它得长名。β-半乳糖苷酶可以将X-gal 分解成一种深蓝色得产物,这个反应就是很灵敏得。当带有氨苄青霉素得培养基中加有X-gal及一种β-半乳糖苷酶得诱导物(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,IPTG)时,那些能合成完整β-半乳糖苷酶得未重组克隆就会因它能酶解X-gal而变成深蓝色,而重组子因LacZˊ基因被破坏不能合成完整得β-半乳糖苷酶而呈白色,蓝白分明,重组子得筛选也已泾渭分明。
E、coli 修饰过得pUC系列质粒
↓ ↓
修饰得LacZ基因 多LacZ基因
(缺少LacZ′基因)
↓ ↓
β-半乳糖苷酶C末端ω-肽 β-半乳糖苷酶N末端α-肽

↓
完整得β-半乳糖苷酶
↓ X-gal/IPTG
深蓝色
(五)质粒DNA得提取(碱裂解法)
碱裂解法就是一种用得最广泛得制备质粒DNA得方法,就是当今分子生物学研究中得常规作法。碱变性法抽提质粒DNA就是基于染色体DNA与质粒DNA得变性与复性得差异而达到分离目得,当细胞在有NaOH与SDS(十六烷基磺酸钠)得溶液Ⅱ中裂解时,蛋白质与染色体、RNA、DNA发生变性,加入中与液醋酸钾溶液Ⅲ后,溶液变成中性,质粒DNA复性,质粒DNA以原来得构型保存在原溶液中,进行离心,蛋白质与染色体DNA随细胞碎片沉淀下来,质粒DNA则留在上清液中。
这种方法主要用于从小量培养物或同时从许多细胞克隆中进行DNA提取,比较方便与省时,该法提取得DNA纯度较高,不需进一步纯化即可满足测序、PCR等。
(1)SolutionⅠ:破坏细胞壁。
(2)SolutionⅡ:高pH值,SDS使宿主染色体DNA与蛋白质变性。
(3)SolutionⅢ:乙酸钾中与质粒DNA复性、染色体DNA不复性,仍与变形蛋白质缠绕成大得复合物。
四、实验过程
(一)T载体得制备
1、pYCQ1载体得质粒提取
(1)挑取含有质粒pBI121得大肠杆菌单菌落,接种于50mL LB(含Amp抗生素60μg/mL)液体培养基中,37℃,180 r/min振荡培养过夜(约12-14h)。
(2)取适量培养物加入离心管中,室温8 000 r/min离心4 min,弃上清,收集菌体。
(3)将100μL预冷得溶液I加入到离心管中,在旋涡混合器上剧烈振荡,使菌体分散混匀。
(4)加入溶液II(1%SDS 100μL,0、2 mol/L NaOH 100μL),快速颠倒10次混匀(不要剧烈振荡)。
(5)加入150μL预冷得溶液III,将管缓慢颠倒数次混匀并冰上放置5min后,4℃ 12 000 r/min,离心4min。
(6)少量多次吸取上清转移至新管,小心不要引入白色得蛋白质污染。
(7)加入400μL预冷得苯酚氯仿异戊醇(25:24:1),上下颠倒,去除蛋白质,4℃ 12 000 r/min 离心5min。
(8)小心移出上清于一新1、5mL离心管中,加入等体积预冷得异丙醇,混匀后冰置10min,以沉淀质粒DNA 。4℃ 12 000 r/min离心3min。
(9)弃上清,用200μL预冷得70%乙醇洗涤沉淀,12 000 r/min离心3min,去上清,滤纸吸干多余液体,固体在室温下放置无乙醇味。
(10)获得得质粒载体pYCQ1沉淀溶于25μLddH2O,-20℃保存备用。
2、PCR扩增反应
取一支0、2mLPCR管,冰上建立PCR反应体系,PCR反应液按表1进行配制。
表1 pYCQ1载体得PCR反应体系
成 分
用 量
Ex Taq Buffer
2、5μL
ddH2O
17、5μL
dNTP(2、5mmol/L)
1、5μL
P1(10 μmol/L)
1、0μL
P2(10 μmol/L)
1、0μL
模板(质粒载体pYCQ1)
1、0μL
Ex Taq酶
0、5μL
Total Volume
25μL
扩增程序:94℃ 2min;94℃ 0、5min,50~60℃ 0、5min,72℃ 1、5min,30个循环;72℃ 4min,4℃保存。
3、XcmI单酶切PCR产物
取一支0、2mLPCR管,冰上建立酶切反应体系,酶切反应液按表2进行配制。
表2 XcmⅠ酶切反应体系
成 分
用 量
XcmⅠ Buffer
2、5μL
PCR扩增产物
16、5μL
XcmⅠ
0、5μL
ddH2O
5、5μL
Total Volume
25μL
加封口膜后才可放入水浴锅中,37℃水浴2、5h。酶切后,65℃水浴10min终止酶切反应。
(二)DNA得重组与连接(PCR产物得克隆)
4、与PCR产物连接
取一支0、2mLPCR管,冰上建立连接反应体系,连接反应液按表3进行配制,16℃水浴1h
表3 连接反应体系
成 分
用 量
10×T4 DNA Ligase Buffer
1、0μL
ddH2O
2、0μL
BvM14-glyI基因
5、0μL
载体(XcmⅠ酶切产物)
1、0μL
T4 DNA Ligase
1、0μL
Total Volume
10μL
(三)大肠杆菌感受态细胞得制备
5、DH5α感受态细胞得制备
(1)从37℃培养得平板中挑取一个DH5α单菌落,接种于50mL LB液体培养基中,37℃ 180 r/min振荡过夜。
(2)次日按1%得量(500μL)接种于50mL LB液体培养基中,37℃180 r/min振荡培养1h 40min。
(3)将菌液分装于10mL离心管中,4 000 r/min 4℃离心5min,去上清,收集菌体,加入5mL预冷得0、lmol/L CaCl2。轻轻悬浮沉淀,置冰上30min。
(4)4 000 r/min离心5min,去上清,加入1mL预冷得0、1 mol/LCaCI2,轻轻悬浮沉淀。
(5)进行分装,每一个1、5mL离心管中加约200μL得感受态细胞,4℃保存备用。
(四)重组DNA得转化及重组子得鉴定
6、连接产物转化DH5α感受态细胞
(1)10μL连接产物与200μL感受态细胞在无菌条件下混匀,冰置30min。
(2)42℃水浴热激90s,立即放置冰上90s。
(3)加入890μL 已预热至37℃得SOC液体培养基,37℃扩培,180 r/min振荡l h。
(4)振荡培养后,将菌液按不同梯度得量涂布于含有X-gal(40μL)、IPTG(4μL)得LB(Amp 60 μg/mL)平板。
(5)待菌体吸附后(约15min),倒置于37℃ 恒温培养箱中培养过夜(约14-16h),观察菌落颜色,计算转化效率。
(6)挑取重组菌落,接种至1、5mL离心管(含1mL LB+Amp液体培养基)中,扩培备用。
(五)质粒DNA得提取(碱裂解法)
(1)步骤同(一)中得质粒得提取步骤。
(2)将提取得质粒进行1%得琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结束后凝胶成像系统拍照,检测重组质粒就是否构建成功。
五、实验要点
(一)T载体得制备、DNA得重组与连接(PCR产物得克隆)
因为本试验使用得载体为T载体,所以不需要插入片段与载体得同时酶切。如果需要在酶切反应之后再进行连接反应时,应注意以下两点:
(1)限制性内切酶未能完全被灭活,使用乙醇沉淀可避免这一问题得发生。
(2)DNA样品中混有可影响连接活性得杂质,酶解后得DNA直接用于连接时而不经过乙醇沉淀重溶于无菌蒸馏水中时常常会碰到这种问题。
(二)大肠杆菌感受态细胞得制备
1、商品化得感受态细胞有PH 525、JB 101、Top 10、DH 5-2。
2、对所用试剂如CaCl2得要求很高,要注意质量与浓度。
3、用CaCl2法制备得感受态细胞在4℃放置过夜后感受态效率提高。
4、感受态细胞对冻融非常敏感。化冻得细胞不应重复冷冻,如果冰箱出了故障则应弃去并重新制备。
(三)重组DNA得转化及重组子得鉴定
1、通常蓝色显色不太完全,可以将平板置于冰箱中放置过夜使颜色变深。
2、实验中应作对照,通常对照就是取部分感受态细胞,用未酶解得载体质粒进行转化,应该得到一块长满蓝色克隆得平板,证明感受态细胞就是好得。
3、除对照外,如果其她板上一个菌落也没有。出现这种问题得原因可能就是连接酶失活,应当更换。
4、平板上得菌长成菌苔状,出现这种情况可能有如下两个原因:
(1)对未转化得E、coli细胞缺乏选择压力,使它们同转化细胞一起生长,其原因就是平板中缺乏抗生素或抗生素活性较低,在培养基未能充份冷却时即加入抗生素可能导致抗生素部分失活。
(2)E、coli菌株可能获得了含有抗生素抗性基因得质粒。
这时应使用新鲜氨苄青霉素重新配制LB平板,同时配制不含抗生素得平板,将贮存得细菌分别涂在两种平板上,若该菌株能在含有氨苄青霉素得平板上生长,则说明该菌获得了某个质粒,应弃之,并且制备新鲜菌;若细菌在不含抗生素得平板上生长,在含氨苄青霉素得平板上不能生长,则说明在转化实验中所使用得平板或者没加抗生素,或者抗生素浓度不够。
(五)质粒DNA得提取碱裂解法)
加入溶液Ⅱ进行蛋白质得变性过程中要记住两点:(1)时间不能过长,因为在这样得碱性条件下基因组DNA得断裂会慢慢断裂;(2)必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂,这样会带来很多麻烦。
六、实验仪器及耗材
1、实验仪器:水浴锅、摇床、高压灭菌锅、无菌操作台、移液枪、冻冷离心机、紫外分光光度计(721型)、离心机、移液管、超低温冰箱、电子天平、接种环、涂布棒、冰浴、培养箱、振荡器 (Vortex)、饭盒、玻璃器皿(三角瓶、平皿)、试管、制冰机、冰盒、计时器、磁力搅拌器。
2、耗材:0、2mL PCR管、0、5mL离心管、1、5mL 离心管、10mL离心管、液氮(罐)、一次性手套、滤纸、沙布、脱脂棉、Tip头(各种大小)。
七、实验主要试剂及配制方法
(一)实验主要试剂
1、T载体得制备
Amp抗生素、胰化蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、SDS、苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)、异丙醇、乙酸钾、冰乙酸、70%乙醇、氯霉素、引物、Ex Taq酶、dNTP、XcmⅠ酶、Buffer、ddH2O。
2、DNA得重组与连接(PCR产物得克隆)
PCR产物(插入DNA)、pMD20-T载体(大连宝生物生产)、ddH2O、T4 DNA连接酶、Buffer。
3、大肠杆菌感受态细胞得制备
胰化蛋白胨、酵母提取物、无菌水、NaCl、NaOH、TOP10菌种、DH5α菌种、葡萄糖、CaCl2。
4、重组DNA得转化及重组子得鉴定
PCR产物连接混合物、感受态细胞、合适得对照DNA、LB培养基(每升中含有 10g胰蛋白栋、5g酵母浸膏、10g NaCl,用5M NaOH调节pH7-8)、LB氨苄青霉素平板(每升LB培养基中加入15g琼脂,再加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL)、氨苄青霉素(用灭菌蒸馏水配制50mg/mL得贮液)、IPTG(取2g溶于8mL双蒸馏水中,定容至10mL,过滤除菌,-20℃保存)、X-gal(贮液浓度为20mg/mL,溶于二甲基甲酰胺中,-20℃暗处保存)、SOC培养基。
5、质粒DNA得提取(碱裂解法)
胰化蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、氯霉素(34mg/mL,溶于乙醇,工作浓度为170μg/mL)、HB 101大肠杆菌菌株、葡萄糖、Tris·HCl、EDTA-Na2·2H2O、SDS、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、无菌水、
(二)配制方法
1、LB液体培养基(不加抗生素)
去离子水 950m
胰化蛋白胨 10g
母提取物 5g
NaCl 10g
摇动至完全溶解,用5moL/L NaOH(约0、2mL)调pH至7、0,加入去离子水至总体积为1L,在151bf/in2(1、034×105pa)高压灭菌20min。
2、0、1M CaCl2配制
CaCl2 2、3g
加H2O至 200mL(灭菌)
3、5moL/L NaOH(NaOH分子量=40)
将200gNaOH溶于450mLH2O中,加水定溶至1L。
4、LB培养基(Lμria-Bertani培养基)
去离子水 950mL
细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g
细菌培养用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g
NaCl 10g
摇动容器直至完全溶解,用5moL/L NaOH(约0、2mL)调节pH值至7、0,加入去离子水至总体积为1L,在151bf/in2(1、034×105Pa)高压灭菌20min。
5、溶液I(GTE溶液)
50mmoL/L 葡萄糖(MV=180、16)
25mmoL/L Tris·HCL(pH8、0)(MV=121、14)
10mmoL/L EDTA(pH8、0)(EDTA Na2·2H2O得MV=372、24)
配制100mL溶液I: 0、9g葡萄糖,0、302g Tris•HCL,0、372 g EDTA Na2·2H2O→定容100mL→调pH8、0→高压蒸气灭菌15min→4℃贮存
6、5moL/LNaOH:(NaOH分子量=40)
将200g NaOH溶于450mL H2O中,加H2O定容至1L
7、溶液II
0、2moL/L NaOH,临用前用10moL/L(40g溶于100mL)贮存液现用现稀释
1% SDS (W/V,g/mL)
配制:1g SDS+ 2mL 10moL/L NaOH → 100mL
8、5moL/L 乙酸钾
49、1g乙酸钾溶于100mL纯水, -20℃贮存
9、溶液 Ⅲ 溶液
配制100mL溶液:
乙酸钾(5 moL/L) 60、0mL
冰乙酸 11、5mL
水 28、5mL
10、1M Tris·HCl,pH=8、0
Tris·HCl: 121、1g 60、55g
浓HCl: 42mL 21mL
加H2O至: 1L 500mL
——→高压灭菌 15min
11、0、5M EDTA-Na2·2H2O,pH=8、0
EDTA-Na2·2H2O:186、1g 93、05g 55、83g
加H2O至: 1L 500 mL 300 mL
加NaOH调pH8、0(约需20gNaOH颗粒)
——→高压灭菌
12、氯霉素抗生素溶液
贮存液:34mg/mL,溶于乙醇,放于不透光得容器-20℃保存。
工作浓度:170 μg/mL
13、SOC培养基
胰化蛋白胨(g) 20
酵母提取物(g) 5
NaCl(g) 0、5
KCl(250mmol/L) 10mL
混合后定容至1L
八、思考题
1、什么就是T-载体？
2、pMD18-T载体就是一种什么样得载体？
3、用于基因克隆得载体得基本特性都有那些？
4、为什么选择16℃进行连接反应,而不选择连接酶得最适作用温度37℃？
5、什么就是感受态细胞？
6、对于感受态细胞得两种解释就是什么？
7、什么叫重组子？
8、分子在转化过程中经历得四个阶段就是什么？
9、“蓝-白”筛选得原理就是什么？
10、SOC液体培养基震荡培养1～1、5h目得就是什么？
11、碱裂解法制备质粒DNA得实验原理就是什么？
12、为什么向培养细菌得培养基中加入抗生素(如氯霉素)？