环境样品前处理-第6章衍生化.ppt

环境样品前处理环境样品前处理环境样品前处理环境样品前处理第第6 6章章 衍生化技术衍生化技术6.1 衍生化目的与条件衍生化目的与条件过程：化学反应过程：化学反应定量转化定量转化适于分析。适于分析。定义：借助化学反应将待测组份接上某种定义：借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法。效果的方法。作用：把难于分析的物质作用：把难于分析的物质转转化为易于分析化为易于分析的物质，通过对反应产物的检测间接分析的物质，通过对反应产物的检测间接分析目标化合物。目标化合物。6.1 衍生化目的与条件衍生化目的与条件1.柱前衍生化：衍生化反应柱前衍生化：衍生化反应定量生成定量生成色谱分析。色谱分析。2.柱后衍生化：色谱柱分离柱后衍生化：色谱柱分离衍生化反应衍生化反应检测。检测。分类：柱前衍生化和柱后衍生化。分类：柱前衍生化和柱后衍生化。流程：流程：机理机理柱前衍生化柱前衍生化柱后衍生化柱后衍生化分离分离-衍生产物衍生产物检测检测-衍生产物衍生产物检测检测-衍生产物衍生产物分离分离-待测物本体待测物本体衍衍生生化化6.1.1衍生化的目的衍生化的目的提高目标提高目标物物可检测性可检测性：1.LC:提高检测灵敏度与选择性灵敏度与选择性2.GC:改善色谱分离改善色谱分离，通过增强目标物挥挥发性发性或者改善目标物极性极性 提高理化稳定性稳定性 为结构鉴定结构鉴定提供依据6.1.2 衍生化的条件衍生化的条件1.柱前衍生化反应需满足的条件：柱前衍生化反应需满足的条件：反应迅速、定量、重复、条件不苛刻、易操作；反应迅速、定量、重复、条件不苛刻、易操作；选择性高、具有专一性；选择性高、具有专一性；反应产物只有一种，无干扰；反应产物只有一种，无干扰；衍生化试剂易得、通用性好。衍生化试剂易得、通用性好。6.1.2 衍生化的条件衍生化的条件2.柱后衍生化反应需满足的条件：柱后衍生化反应需满足的条件：反应迅速反应迅速反应迅速反应迅速、定量、重复；、定量、重复；反应条件与色谱反应条件与色谱条件适应条件适应；反应反应产物可检测产物可检测；6.2.1气相色谱柱前衍生化气相色谱柱前衍生化（1 1）硅烷化硅烷化衍生化方法衍生化方法（2 2）酯化酯化衍生化方法衍生化方法（3 3）卤化卤化衍生化方法衍生化方法（4 4）酰化酰化衍生化方法衍生化方法方法方法6.2 衍生化方法衍生化方法1.硅烷化衍生化方法硅烷化衍生化方法本节首页本节首页退出本章退出本章质质子子性性化化合合物物如如醇醇、酚酚、酸酸、胺胺等等与与硅硅烷化试剂烷化试剂反应，形成反应，形成挥发性的挥发性的硅烷衍生物硅烷衍生物R R3 3SiSiX+X+H H H HRRRRR R R R3 3 3 3SiSiSiSiRRRR+H+HX XP135表表6-12.酯化衍生化方法酯化衍生化方法大多数有有机机酸酸挥发性、热稳定性差。在GC分析之前衍生为相应的酯酯。甲醇法 重氮甲烷法 三氟乙酸酐法 酯化酯化反应反应 甲醇法甲醇法本节首页本节首页退出本章退出本章甲甲醇醇法法：有机酸与甲醇在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，生成有机酸甲酯有机酸甲酯RCOOH+RCOOH+CHCHCHCH3 3 3 3OHOHOHOH催化剂催化剂RCOOCHRCOOCHRCOOCHRCOOCH3 3 3 3+H+H2 2O O 硫酸、盐酸硫酸、盐酸-加热加热 三氟化硼三氟化硼三氟化硼三氟化硼BFBF3 3-室温室温催化剂催化剂 重氮甲烷法重氮甲烷法本节首页本节首页退出本章退出本章非水介质中CHCHCHCH2 2 2 2N N N N2 2 2 2与有机酸反应，生成有机酸甲酯有机酸甲酯有机酸甲酯有机酸甲酯RCOOH+RCOOH+CHCHCHCH2 2 2 2N N N N2 2 2 2RCOOCHRCOOCHRCOOCHRCOOCH3 3 3 3+N+N2 2重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒！三氟乙酸酐法三氟乙酸酐法本节首页本节首页退出本章退出本章醇或酚与有机酸反应，生成酯：RCOOH+ROHRCOOR+H2O适合空间位阻较大的化合物。三氟乙酸酐三氟乙酸酐3.酰化衍生化方法酰化衍生化方法本节首页本节首页退出本章退出本章 在在-OH、-SH、-NH等含有活泼氢的化合物上等含有活泼氢的化合物上引引入入酰基酰基酰基酰基转化为弱转化为弱极性的极性的酯、硫酯或酰胺酯、硫酯或酰胺改善改善挥发性和稳定性，挥发性和稳定性，含有卤离子的羰基基团可增强含有卤离子的羰基基团可增强ECD响应。响应。优点：优点：保护不稳定基团；保护不稳定基团；提高糖类，氨基酸等物质的挥发性和热稳性；提高糖类，氨基酸等物质的挥发性和热稳性；有助于混合物分离；有助于混合物分离；使用使用ECD检测，分析物检测下限可降低很多。检测，分析物检测下限可降低很多。3.酰化衍生化方法酰化衍生化方法本节首页本节首页退出本章退出本章（1）乙酰化法：提高）乙酰化法：提高挥发性挥发性挥发性挥发性试剂：乙酸酐（试剂：乙酸酐（AA）样品：糖类样品：糖类介质：多为非水介质：多为非水催化剂：吡啶等碱性化合物催化剂：吡啶等碱性化合物3.酰化衍生化方法酰化衍生化方法本节首页本节首页退出本章退出本章（2）多氟酰化法：引入）多氟酰化法：引入卤素！卤素！卤素！卤素！试剂：三氟乙酸酐（试剂：三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐）、五氟丙酸酐（PFP）、七氟丁酸酐（）、七氟丁酸酐（HFB）、）、N-甲基双（三甲基双（三氟乙酸酐）咪唑（氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、）、1-(三氟乙酰三氟乙酰)咪唑咪唑（TFAI）样品：药物等大分子样品：药物等大分子介质：非水介质：非水4.卤化衍生化方法卤化衍生化方法本节首页本节首页退出本章退出本章引入卤素ECD检测器改善挥发性和稳定性。1）卤素法：加成加成或取代取代 4.卤化衍生化方法卤化衍生化方法本节首页本节首页退出本章退出本章（2）卤化氢法：加成加成或置换置换（3）NBS法：烯丙位取代烯丙位取代 P137 HPLC化学衍生化分类 在线化学衍生化 是否与HPLC系统联机 离线化学衍生化 柱前衍生化 发生衍生化发应的先后 柱后衍生化本节首页本节首页退出本章退出本章6.2.2 液相色谱柱前衍生化液相色谱柱前衍生化1.1.紫外衍生化反应紫外衍生化反应2 2荧光衍生化反应荧光衍生化反应 3 3电化学衍生化反应电化学衍生化反应优点：优点：（1）对用作流动相的溶剂体系没有限制；（2）反应条件，反应速率不受限制；（3）通过选择合适的试剂以及萃取方法，可以 消除许多干扰；（4）过量溶剂、试剂容易除去；（5）转变成合适的衍生物，可使分离度改进。缺点缺点:（1）操作过程繁琐，容易影响定量准确性。（2）当一个复杂组分样品经过衍生化反应 后，有可能产生多种衍生化产物给色 谱分离带来困难。本节首页本节首页退出本章退出本章（1）紫外衍生化反应）紫外衍生化反应 液相色谱法中，紫外吸收检测器是最常见的一种高灵敏度检测器 很多化合物在紫外可见光谱区无吸收 与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下发生反应，反应产物带有发色基团而能被紫外吸收检测器检测。本节首页本节首页退出本章退出本章（1）紫外衍生化反应）紫外衍生化反应苯苯甲甲酰酰氯氯+胺、醇、酚苯苯甲甲酸酸酯酯类衍生物（）（1 1）苯甲酰化反应）苯甲酰化反应 本节首页本节首页退出本章退出本章（1）紫外衍生化反应）紫外衍生化反应（2 2）苯甲磺酰化反应）苯甲磺酰化反应 （3 3）DNFBDNFB与醇、胺、氨基酸反应与醇、胺、氨基酸反应 （4 4）PITCPITC与氨基酸反应与氨基酸反应 （5 5）有机酸酯化反应）有机酸酯化反应 （6 6）羰基与）羰基与DNPADNPA或或PNBAPNBA反应反应 P139-140 P139-140:更多反应：更多反应：P137-138P137-138表表6-26-2（2）荧光衍生化反应）荧光衍生化反应定义：用含有芳香环或杂环芳香环或杂环芳香环或杂环芳香环或杂环的大基团取代被测化合物分子中的一个或几个原子，以此将荧光物标记入分子，此时被测分子的结构基本不变特点：高选择性、高灵敏度荧光检测器灵敏度比紫外检测器的灵敏度高10到1000倍（2）荧光衍生化反应）荧光衍生化反应例：福多司坦血药浓度测定方法的建立例：福多司坦血药浓度测定方法的建立 2 2、半胱氨酸结构式：半胱氨酸结构式：1、福多司坦结构式、福多司坦结构式:结结 构构 特特 点点 3、结构特点：、结构特点：为半胱氨酸衍生物；为半胱氨酸衍生物；没有强的紫外吸收，没有强的紫外吸收，没有荧光；没有荧光；分子量小，极性大。分子量小，极性大。羧基羧基伯氨基伯氨基衍生化产物的激发波衍生化产物的激发波长为长为338 nm，发射发射波长为波长为450 nm反应过程：反应过程：参考氨基酸的测定方法，选择合适的衍生化试剂参考氨基酸的测定方法，选择合适的衍生化试剂衍生化后测定：衍生化后测定：荧光衍生试剂荧光衍生试剂常用的荧光衍生化试剂（亦称荧光探针）有：荧光衍生试剂的基本构成荧光衍生试剂的基本构成取代基荧光团（试剂分子母体）反应基团胆磺酰肼 DNS-H荧光衍生化试剂亦称荧光探针荧光探针荧光探针荧光探针P140P140表表6-36-3常用的荧光衍生试剂常用的荧光衍生试剂1.丹磺酰氯（丹磺酰氯（1-二甲氨基萘二甲氨基萘-5-磺酰氯）磺酰氯）2.丹酰肼（丹酰肼（1-二甲氨基萘二甲氨基萘-5-磺酰肼）磺酰肼）荧光衍生化试剂的分类：（一）（一）（一）（一）胺的衍生试剂胺的衍生试剂胺的衍生试剂胺的衍生试剂（二）（二）（二）（二）醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂（三）（三）（三）（三）羰基化合物的衍生试剂羰基化合物的衍生试剂羰基化合物的衍生试剂羰基化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂邻苯二甲醛邻苯二甲醛 OPA4-氯氯-7-硝基硝基-2,1,3-苯并恶二唑苯并恶二唑 NBD-Cl荧光素异硫氰酸酯荧光素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC（一）胺的衍生试剂：（二）醇、酚的衍生试剂:羰基氯类：FMOC,CEOC磺酰氯类:DNs-Cl卤代三嗪类:EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）（三）羰基化合物的衍生试剂:肼类肼类 DNs-HCEOC-H 氨基类氨基类 氨基甲基芘氨基甲基芘（四）羧酸类化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂:溴甲基类溴甲基类 BrMMC 哌嗪基类哌嗪基类 DBD-Pz7-N-哌嗪哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃二甲氨基苯并呋喃(4-溴甲基溴甲基-7-甲氧基香豆素甲氧基香豆素)（四）羧酸类化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂:重氮甲烷基类重氮甲烷基类 ADAM 其它类其它类 9-(2-9-(2-羟乙基羟乙基)-)-吖啶酮吖啶酮 HEA4-氨甲基氨甲基-6，7-二甲基香豆素二甲基香豆素(ADMC)9-蒽重氮甲烷蒽重氮甲烷（3）电化学衍生化反应）电化学衍生化反应样品与某些试剂反应，生成具有电化学活电化学活性性的衍生物，以便在电化学检测器上有较高的响应。环境介质对电化学反应有很大影响，如离子强度、pH值和溶剂组成等。常用的电化学衍生化试剂：（1）带硝基的芳香化合物）带硝基的芳香化合物：P141表表6-4（2）芳氨基、酚羟基）芳氨基、酚羟基等上述试剂与羟基、氨基、羧基、羰基化合物反应生成具有电化学活性的衍生物。6.2.3 柱后衍生过程柱后衍生过程 将样品先注入色谱柱，按选定的色谱条件使样品组分得以分离；当各个组分从色谱柱流出后，分别与衍生化试剂相遇，在一定的反应条件下，生成具有某种检测特性的衍生化产物 进入检测器测定。要求：要求：（1）对流动相的选择更严格，必须考虑衍生化 试剂、反应产物的溶解度，以及它们与流 动相可能发生的副反应；（2）在高效液相色谱中采用高流速，因此 反应速率反应速率必须很快（小于30s）；（3）检测器对衍生化试剂不能有响应。柱后衍生流程图柱后衍生流程图泵泵泵泵进进进进样样样样阀阀阀阀色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱衍生化试剂泵衍生化试剂泵衍生化试剂泵衍生化试剂泵衍生化反应器衍生化反应器衍生化反应器衍生化反应器检检检检测测测测器器器器记记记记录录录录仪仪仪仪柱后反应器柱后反应器1.毛细管式毛细管式2.空气分割式空气分割式3.填充柱式填充柱式P143图图6-26.2.4 固相化学衍生化法固相化学衍生化法（1）还原型固相反应剂 1.1.固相化学反应剂固相化学反应剂固相化学反应剂固相化学反应剂6.2.4 固相化学衍生化法固相化学衍生化法 酶是一种具有特殊三度空间构象的蛋白质，能够催化某一底物进行特异性化学反应，生成特定的反应产物。酶的催化反应具有高度的专一性酶试剂通常在反应中是不消失的，可重复使用酶的固定化可分为化学和物理两种方法，化学法是指在酶和载体之间生成共价键，并保留其生物活性，而物理方法仅是吸附在固体表面。2.2固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶2.固定化酶固定化酶对载体的要求：对酶应有较高的亲和力和较大的容量、易再生。一般大孔径、大表面积的载体容量大，而容量越大，固定化酶的活性越高，寿命越长。硅球、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素等都可以作为载体。如纤维素或葡聚糖凝胶与溴化氰反应，然后用酶处理：2.固定化酶固定化酶酶一旦被固定，其稳定性增加。利用酶反应的专一性完成的衍生化反应，可以改变底物的化学特性，提高色谱分析的灵敏度和选择性。P144图 6-3 本节首页本节首页退出本章退出本章 制备衍生物的反应罐瓶制备衍生物的反应罐瓶 其它衍生化方法：其它衍生化方法：手性衍生化手性衍生化 用手性试剂与外消旋体反应，在分子内导入另一手性中心，柱前衍生反应生成一对非对映异构体，两者间无镜相关系，物理化学性质不同，可用常规的色谱分离条件进行分离。手性衍生化分离通常基于以下原因：手性衍生化分离通常基于以下原因：不宜直接拆分，如游离胺类在手性固定相上往往呈颇弱的色谱性质，生成中性化合物则获得显著改善 添加某些基团，以增加色谱系统的对映异构选择性 提高紫外或荧光检测的效果6.3 衍生化技术在环境分析中的应用衍生化技术在环境分析中的应用P144作业1.画出柱后衍生流程示意图。2.用表格形式总结气相色谱柱前衍生化的方法原理和化学反应式实验课时间：5.22，5.29，6.5下午2：20集合地点：西门-互助巷口学习地点：礼让街23号单位：青海出入境检验检疫局，五楼