GB 5009.169-2016 食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 6食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定2 0 1 6 - 0 8 - 3 1发布2 0 1 6 - 0 9 - 2 0实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.1 6 92 0 0 3 食品中牛磺酸的测定 和G B5 4 1 3.2 62 0 1 0 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定 。本标准与G B/T5 0 0 9.1 6 92 0 0 3相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定” ; 增加了O P A柱后衍生高效液相色谱法为第一法; 增加了丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法为第二法; 删除了薄层色谱法。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 61 食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定1 范围本标准规定了食品中牛磺酸测定的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、 乳粉、 豆粉、 豆浆、 含乳饮料、 特殊用途饮料、 风味饮料、 固体饮料、 果冻中牛磺酸的测定。第一法 邻苯二甲醛(O P A) 柱后衍生高效液相色谱法2 原理试样用水溶解, 用偏磷酸沉淀蛋白, 经超声波震荡提取、 离心、 微孔膜过滤后, 通过钠离子色谱柱分离, 与邻苯二甲醛(O P A) 衍生反应, 用荧光检测器进行检测, 外标法定量。3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 偏磷酸。3.1.2 柠檬酸三钠。3.1.3 苯酚。3.1.4 硝酸。3.1.5 甲醇: 色谱纯。3.1.6 硼酸。3.1.7 氢氧化钾。3.1.8 邻苯二甲醛(O P A) 。3.1.9 2 -巯基乙醇。3.1.1 0 聚氧乙烯月桂酸醚(B r i j - 3 5) 。3.1.1 1 亚铁氰化钾。3.1.1 2 乙酸锌。3.1.1 3 淀粉酶: 活力1.5U/m g。3.2 试剂配制3.2.1 偏磷酸溶液(3 0g/L)称取3 0.0g偏磷酸(3.1.1) , 用水溶解并定容至10 0 0m L。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 62 3.2.2 柠檬酸三钠溶液称取1 9.6g柠檬酸三钠(3.1.2) , 加9 5 0m L水溶解, 加入1m L苯酚(3.1.3) , 用硝酸(3.1.4) 调p H至3.1 03.2 5, 经0.4 5m微孔滤膜过滤。3.2.3 柱后荧光衍生溶液( 邻苯二甲醛溶液)3.2.3.1 硼酸钾溶液(0.5m o l/L) : 称取3 0.9g硼酸(3.1.6) ,2 6.3g氢氧化钾(3.1.7) , 用水溶解并定容至10 0 0m L。3.2.3.2 邻苯二甲醛衍生溶液: 称取0.6 0g邻苯二甲醛(3.1.8) , 用1 0m L甲醇(3.1.5) 溶解后, 加入0.5m L2 -巯基乙醇(3.1.9) 和0.3 5gB r i j - 3 5(3.1.1 0) , 用0.5 m o l/L硼酸钾溶液(3.2.3.1) 定容至10 0 0m L, 经0.4 5m微孔滤膜过滤。临用前现配。3.2.4 沉淀剂3.2.4.1 沉淀剂: 称取1 5.0g亚铁氰化钾(3.1.1 1) , 用水溶解并定容至1 0 0m L。该沉淀剂在室温下3个月内稳定。3.2.4.2 沉淀剂: 称取3 0.0g乙酸锌(3.1.1 2) , 用水溶解并定容至1 0 0m L。该沉淀剂在室温下3个月内保持稳定。3.3 标准品纯度9 9%,C A S:1 0 7 - 3 5 - 7。3.4 标准溶液配制3.4.1 牛磺酸标准储备溶液(1m g/m L)准确称取0.1 0 00g牛磺酸标准品(3.3) , 用水溶解并定容至1 0 0m L。3.4.2 牛磺酸标准工作液将牛磺酸标准储备溶液(3.4.1) 用水稀释制备一系列标准溶液, 标准系列浓度为:0g/m L、5.0g/m L、1 0.0g/m L、1 5.0g/m L、2 0.0g/m L、2 5.0g/m L, 临用前现配。4 仪器和设备4.1 高效液相色谱仪: 带有荧光检测器。4.2 柱后反应器。4.3 荧光衍生溶剂输液泵。4.4 超声波震荡器。4.5 p H计: 精度0.0 1。4.6 离心机: 不低于50 0 0r/m i n。4.7 微孔滤膜:0.4 5m。4.8 天平: 感量0.0 0 01g。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 63 5 分析步骤5.1 试样制备准确称取固体试样1g 5g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入4 0左右温水2 0m L, 摇匀使试样溶解, 放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n。再加5 0m L偏磷酸溶液(3.2.1) , 充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n 1 5m i n, 取出冷却至室温后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度并摇匀; 样液在50 0 0r/m i n条件下离心1 0m i n, 取上清液经0.4 5m微孔膜(4.7) 过滤, 接取中间滤液以备进样。谷类制品, 称取试样5g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入4 0左右温水4 0m L, 加入淀粉酶( 酶活力1.5U/m g)0.5g, 混匀后向锥形瓶中充入氮气, 盖上瓶塞, 置5 06 0培养箱中3 0m i n, 取出冷却至室温, 再加5 0m L偏磷酸溶液(3.2.1) , 充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n 1 5m i n,取出冷却至室温后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度并摇匀; 样液在50 0 0r/m i n条件下离心1 0m i n, 取上清液经0.4 5m微孔膜(4.7) 过滤, 接取中间滤液以备进样。准确称取液体试样( 乳饮料除外)5g3 0g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加5 0m L偏磷酸溶液(3.2.1) , 充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n1 5m i n, 取出冷却至室温后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度并摇匀; 样液在50 0 0r/m i n条件下离心1 0m i n, 取上清液经0.4 5m微孔膜(4.7) 过滤, 接取中间滤液以备进样。牛磺酸含量高的饮料类先用水稀释到适当浓度, 最后一步稀释时, 加入5 0m L偏磷酸溶液(3.2.1)充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n1 5m i n, 取出冷却至室温后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度并摇匀; 样液在50 0 0r/m i n条件下离心1 0m i n, 取上清液经0.4 5m微孔膜(4.7)过滤, 接取中间滤液以备进样。果冻类试样, 称取试样5g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入2 0m L水,5 06 0水浴2 0m i n使之溶解, 冷却后, 加入5 0m L偏磷酸溶液(3.2.1) 充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n1 5m i n, 取出冷却至室温后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度并摇匀; 样液在50 0 0r/m i n条件下离心1 0m i n, 取上清液经0.4 5m微孔膜(4.7) 过滤, 接取中间滤液以备进样。乳饮料试样, 称取5g 3 0g试样( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入4 0左右温水3 0m L, 充分混匀, 置超声波振荡器上超声提取1 0m i n, 冷却到室温。加1.0m L沉淀剂(3.2.4.1) , 涡旋混合,1.0m L沉淀剂(3.2.4.2) , 涡旋混合, 转入1 0 0m L容量瓶中用水定容至刻度, 充分混匀, 样液于50 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液经0.4 5m微孔膜(4.7) 过滤, 接取中间滤液以备进样。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱柱: 钠离子氨基酸分析专用柱(2 5c m4.6mm) 或相当者。5.2.2 流动相: 柠檬酸三钠溶液(3.2.2) 。5.2.3 流动相流速:0.4m L/m i n。5.2.4 荧光衍生溶剂流速:0.3m L/m i n。5.2.5 柱温:5 5。5.2.6 检测波长: 激发波长:3 3 8n m, 发射波长:4 2 5n m。5.2.7 进样量:2 0L。5.3 标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中, 测定相应的色谱峰高或峰面积, 以标准工作液的浓度为横坐标, 以响应值( 峰面积或峰高) 为纵坐标, 绘制标准曲线。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 64 5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中, 得到色谱峰高或峰面积, 根据标准曲线得到待测液中牛磺酸的浓度, 平行测定次数不少于两次。6 分析结果的表述试样中牛磺酸含量按式(1) 计算:A=cVm10 0 01 0 0(1) 式中:A 试样中牛磺酸的含量, 单位为毫克每百克(m g/1 0 0g) ;c 试样测定液中牛磺酸的浓度, 单位为微克每毫升(g/m L) ;V 试样定容体积, 单位为毫升(m L) ;m 试样质量, 单位为克(g) 。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。8 其他当取样量为1 0.0 0g时, 方法检出限为:0.2m g/1 0 0g; 定量限为0.5m g/1 0 0g。第二法 丹磺酰氯柱前衍生法9 原理试样用水溶解, 用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质。取上清液用丹磺酰氯衍生反应, 衍生物经C1 8反相色谱柱分离。用紫外检测器(2 5 4n m) 或荧光检测器( 激发波长:3 3 0n m; 发射波长:5 3 0n m) 检测,外标法定量。1 0 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 0.1 试剂1 0.1.1 乙腈: 色谱纯。1 0.1.2 冰乙酸。1 0.1.3 盐酸。1 0.1.4 无水碳酸钠。1 0.1.5 乙酸钠。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 65 1 0.1.6 盐酸甲胺( 甲胺盐酸盐) 。1 0.1.7 丹磺酰氯(5 -二甲氨基萘- 1 -磺酰氯) : 色谱纯。注:丹磺酰氯对光和湿敏感不稳定, 在干燥器中避光保存。1 0.2 试剂配制1 0.2.1 盐酸溶液(1m o l/L) : 吸取9m L盐酸(1 0.1.3) , 用水稀释并定容到1 0 0m L。1 0.2.2 碳酸钠缓冲液(p H9.5) (8 0mm o l/L) : 称取0.4 2 4g无水碳酸钠(1 0.1.4) , 加4 0m L水溶解, 用1m o l/L盐酸溶液(1 0.2.1) 调p H至9.5, 用水定容至5 0m L。该溶液在室温下3个月内稳定。1 0.2.3 丹磺酰氯溶液(1.5m g/m L) : 称取0.1 5g丹磺酰氯(1 0.1.7) , 用乙腈(1 0.1.1) 溶解并定容至1 0 0m L。 临使用前配制。1 0.2.4 盐酸甲胺溶液(2 0m g/L) : 称取2.0g盐酸甲胺(1 0.1.6) , 用水溶解并定容至1 0 0m L。该溶液保存在4下3个月内稳定。1 0.2.5 乙酸钠缓冲液(1 0mm o l/L,p H4.2) : 称取0.8 2 0g乙酸钠(1 0.1.5) , 加8 0 0m L水溶解, 用冰乙酸(1 0.1.2) 调节p H至4.2, 用水定容至10 0 0m L, 经0.4 5m微孔滤膜过滤。1 0.3 标准品纯度9 9%,C A S:1 0 7 - 3 5 - 7。1 0.4 标准溶液配制1 0.4.1 牛磺酸标准储备溶液(1m g/m L)准确称取0.1 0 00g牛磺酸标准品(3.3) , 用水溶解并定容至1 0 0m L。1 0.4.2 牛磺酸标准工作液( 紫外检测器用)将牛磺酸标准储备溶液(1 0.4.1) 用水稀释制备一系列标准溶液, 标准系列浓度为:0g/m L、5.0g/m L、1 0.0g/m L、1 5.0g/m L、2 0.0g/m L、2 5.0g/m L, 临用前现配。1 0.4.3 牛磺酸标准工作液( 荧光检测器用)将牛磺酸标准储备溶液(1 0.4.1) 用水稀释制备一系列标准溶液, 标准系列浓度为:0g/m L、0.5g/m L、2.0g/m L、5.0g/m L、1 0.0g/m L、2 0.0g/m L, 临用前现配。1 1 仪器和设备1 1.1 高效液相色谱仪: 带有荧光检测器或紫外检测器或二极管阵列检测器。1 1.2 涡旋混合器。1 1.3 超声波震荡器。1 1.4 p H计: 精度0.0 1。1 1.5 离心机: 不低于50 0 0r/m i n。1 1.6 微孔滤膜:0.4 5m。1 1.7 天平: 感量0.0 0 01g、0.0 0 1g。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 66 1 2 分析步骤1 2.1 试样制备1 2.1.1 试液提取准确称取固体试样1g 5g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入4 0左右温水4 0m L, 摇匀使试样溶解, 放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n。冷却到室温, 加1.0m L沉淀剂(3.2.4.1) , 涡旋混合,1.0m L沉淀剂(3.2.4.2) , 涡旋混合, 转入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度, 充分混匀。样液于50 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。上清液在4暗处保存放置2 4h内稳定。谷类制品, 称取试样5g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入4 0左右温水4 0m L, 加入淀粉酶( 酶活力1.5U/m g)0.5g, 混匀后向三角瓶中充入氮气, 盖上瓶塞, 置5 06 0培养箱中3 0m i n, 取出冷却至室温。放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n。冷却到室温, 加1.0m L沉淀剂(3.2.4.1) , 涡旋混合,1.0m L沉淀剂(3.2.4.2) , 涡旋混合, 转入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度, 充分混匀。样液于50 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。上清液在4暗处保存放置2 4h内稳定。准确称取液体试样( 乳饮料试样除外)5g 3 0g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加2 0m L水, 充分摇匀。加1.0m L沉淀剂(3.2.4.1) , 涡旋混合,1.0m L沉淀剂(3.2.4.2) , 涡旋混合, 转入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度, 充分混匀。样液于50 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。上清液在4暗处保存放置2 4h内稳定。牛磺酸含量高的饮料类先用水稀释到适当浓度, 最后一步稀释时, 于锥形瓶中加1.0m L沉淀剂(3.2.4.1) , 涡旋混合,1.0m L沉淀剂(3.2.4.2) , 涡旋混合, 之后转入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度, 充分混匀, 样液于50 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。上清液在4暗处保存放置2 4h内稳定。果冻类试样, 称取试样5g( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入2 0m L水,5 06 0水浴2 0m i n使之溶解, 冷却后, 加入5 0m L偏磷酸溶液(3.2.1) 充分摇匀, 放入超声波振荡器中超声提取1 0m i n1 5m i n, 取出冷却至室温后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度并摇匀; 样液在50 0 0r/m i n条件下离心1 0m i n, 取上清液备用。上清液在4暗处保存放置2 4h内稳定。乳饮料试样, 称取5g 4 0g试样( 精确至0.0 1g) 于锥形瓶中, 加入4 0温水2 0m L, 充分混匀, 置超声波振荡器上超声提取1 0m i n, 冷却到室温。加1.0m L沉淀剂(3.2.4.1) , 涡旋混合,1.0m L沉淀剂(3.2.4.2) , 涡旋混合, 转入1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度, 充分混匀, 样液于50 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。上清液在4暗处保存放置2 4h内稳定。1 2.1.2 试液衍生化准确吸取1.0 0m L1 2.1.1所得上清液到1 0m L具塞玻璃试管中, 加入1.0 0m L碳酸钠缓冲液(1 0.2.2) ,1.0 0m L丹磺酰氯溶液(1 0.2.3) , 充分混合, 室温避光衍生反应2h(1h后需摇晃1次) , 加入0.1 0m L盐酸甲胺溶液(1 0.2.4) 涡旋混合, 以终止反应, 避光静置至沉淀完全。取上清液经0.4 5m微孔滤膜(1 1.6) 过滤, 取滤液备用。衍生物在4以下可避光保存4 8h。另取1.0 0m L标准工作液(1 0.4.2) , 与试液同步进行衍生。1 2.2 仪器参考条件1 2.2.1 色谱柱:C1 8反相色谱柱(2 5 0mm4.6mm,5m) 或相当者。1 2.2.2 流动相: 乙酸钠缓冲液(1 0.2.5)+乙腈(1 0.1.1)=7 0+3 0( 体积比) 。1 2.2.3 流动相流速:1.0m L/m i n。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 67 1 2.2.4 柱温: 室温。1 2.2.5 检测波长: 荧光检测器: 激发波长:3 3 0n m, 发射波长:5 3 0n m。紫外检测器或二极管阵列检测器:2 5 4n m。1 2.2.6 进样量:2 0L。1 2.3 标准曲线的制作将标准系列工作液的衍生液分别注入高效液相色谱仪中, 测定相应的色谱峰高或峰面积, 以标准工作液的浓度为横坐标, 以响应值( 峰面积或峰高) 为纵坐标, 绘制标准曲线。1 2.4 试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中, 得到色谱峰高或峰面积, 根据标准曲线得到待测液中牛磺酸的浓度, 平行测定次数不少于两次。1 3 分析结果的表述试样中牛磺酸含量按式(2) 计算:A=cVm10 0 01 0 0(2) 式中:A 试样中牛磺酸的含量, 单位为毫克每百克(m g/1 0 0g) ;c 试样测定液中牛磺酸的浓度, 单位为微克每毫升(g/m L) ;V 试样定容体积, 单位为毫升(m L) ;m 试样质量, 单位为克(g) 。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字。1 4 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。1 5 其他当取样量为1 0.0 0g时, 荧光检测法检出限为0.0 5m g/1 0 0g; 定量限为:0.1m g/1 0 0g。紫外检测法检出限为1.5m g/1 0 0g; 定量限为:5m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 68 附 录 A色谱图A.1 邻苯二甲醛(O P A) 柱后衍生法液相色谱图邻苯二甲醛(O P A) 柱后衍生法液相色谱图见图A.1。a) 标准溶液色谱图b) 试样色谱图图A.1 邻苯二甲醛(O P A) 柱后衍生法液相色谱图A.2 单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图( 紫外检测)单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图( 紫外检测) 见图A.2。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 69 a) 标准溶液色谱图b) 试样色谱图图A.2 单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图( 紫外检测)A.3 单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图( 荧光检测)单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图( 荧光检测) 见图A.3。G B5 0 0 9.1 6 92 0 1 61 0 a) 标准溶液色谱图b) 试样色谱图图A.3 单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图( 荧光检测)