钴−生物质炭人工酶的制备及其在土壤氯辛硫磷残留检测中的应用.pdf

钴生物质炭人工酶的制备及其在土壤氯辛硫磷残留检测中的应用曹志军，贺根和，张 凯，罗旭彪（井冈山大学 生命科学学院，江西 吉安343009）摘要 金属纳米材料人工酶由于具有较高的类氧化酶活性、良好的稳定性和较低的制备成本而被广泛研究和应用于生物传感与催化领域。本研究将梨瓜皮溶解分散于钴基水杨酸咪唑离子液体得到均匀的浆液，冷冻干燥后，经高温热解制得钴生物质炭纳米复合材料人工酶。研究表明，钴生物质炭纳米复合材料具有优异的分散性，平均粒径为 50 nm，钴纳米粒子分布于生物质炭片表面，使其展现出较高的类氧化酶活性。基于氯辛硫磷对钴生物质炭人工酶活性的抑制作用，建立测定氯辛硫磷的比色检测方法。氯辛硫磷的存在将抑制钴生物质炭人工酶催化 3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）氧化成蓝色产物的活性，使得 TMB 氧化产物体系吸光度下降。反应体系的吸光度随着氯辛硫磷浓度（0.550 molL1）的增大而线性降低，检出限为 40 nmolL1。这一检测方法简便快捷，可用于土壤中氯辛硫磷残留的快速测定。关键词 生物质炭；农业土壤；类氧化酶；农药残留；比色检测 中图分类号 O657.3;TS255.7 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.2096-8566.2023.03.010 文章编号 2096-8566(2023)03-0095-08Synthesis of Cobalt-biocarbon Mimic Enzyme and its Application in DetectingChlorphoxim in SoilCAO Zhi-jun，HE Gen-he，ZHANG Kai，LUO Xu-biao（School of Life Sciences,Jinggangshan University,Jiangxi Jian 343009,China）Abstract:Metallic nanomaterial artificial enzymes have been studied and applied in the field of biocatalysis and biosensing due totheir high peroxidase-like activity,stability,and low preparation cost.In this study,melon peel was dissolved and dispersed in aimidazolium Co-based salicylate ionic liquid to obtain a homogeneous slurry.Cobalt-biomass carbon nanocomposite artificialenzymes were synthesized after the high-temperature pyrolysis of the resultant solid from the above slurry by freeze-drying.Theresults show that the cobalt-biomass carbon nanocomposites(ca.50 nm in diameter)has excellent dispersibility and distribute on thesurface of biomass carbon sheets,which exhibit high peroxidase-like activity.Based on the inhibitory effect of chlorphoxim on theactivity of cobalt-biomass carbon artificial enzymes,a colorimetric detection method for chlorphoxim was proposed.Aschlorphoxim can inhibit the activity of cobalt-biomass carbon artificial enzymes in catalyzing the oxidation of 3,3,5,5-Tetramethylbenzidine (TMB),the yield of corresponding blue product is declined,presented as decreased absorbance.Theabsorbance of the reaction system decreases linearly with the increased chlorphoxim concentration when ranging from 0.5 to 50mol L1,and the detection limit is 40 nmol L1.The detection method is simple and rapid,which can be used for the fastdetermination of chlorphoxim residues in soil.收稿日期2023-08-01 修回日期2023-08-31基金项目江西省自然科学基金项目（20202ACBL203011）通讯作者罗旭彪（1977），男，博士，教授。主要研究方向：废水治理与资源化的原理、技术和工程应用。第 37 卷 第 3 期南昌航空大学学报：自然科学版Vol.37 No.32023 年 9 月Journal of Nanchang Hangkong University:Natural SciencesSept.2023 Key words:biocarbon；agricultural soil；oxidase-like enzyme；pesticide residue；colorimetric detection 引言我国南方红壤区是生物多样性最丰富的地区之一，生物多样性资源开发具有天然的优势1，但开发过程中也不断出现环境问题2。近年来，农药的大量使用使得环境中有过量的农药残留，给动植物和人的身体健康带来了巨大的潜在威胁3。及时监测环境中的农药残留，控制农药的使用量是解决这一环境问题的有效手段4-5。氯辛硫磷是一种广谱杀虫剂，持效性和稳定性较好。具有胃毒和触杀作用，常用于防治仓贮和土壤害虫。由于药效持久、稳定性好，氯辛硫磷易残留在农业土壤中6。残留的氯辛硫磷会对人体构成潜在的毒性，会对人体呼吸系统、消化系统以及神经系统造成损伤，还会影响到正常的心脏功能，严重时会引起生命危险。所以开发准确、快速、高灵敏度的氯辛硫磷残留检测方法具有重要的现实意义7。目前氯辛硫磷残留检测的主要方法是气相色谱法或高效液相色谱法8-10。该类方法是实验室常用的农药检测方法，具有较高的灵敏度和选择性，但样品预处理繁琐，需要昂贵的仪器和熟练的操作人员，检测时间长，还必须在固定的实验室中操作，这极大地限制了该类方法在现场快速检测中的应用，无法满足基层农产品质量安全监管的需要。酶抑制比色法具有成本低、操作简单、读数直观的优势，因而受到更多的关注11-13。现有比色法通常采用天然氧化酶，但是天然氧化酶容易失活，对温度和 pH 敏感，难以长期储存，给实际应用带来诸多不便。金属纳米材料人工酶比天然酶的稳定性更好，成本更低，研究制备适用于氯辛硫磷检测的具有较高活性的人工酶势在必行14-17。金纳米晶体等人工酶纳米材料已被研究应用于有机磷农药的检测，但较高的成本和较差的催化活性限制了其在农药残留检测方面的广泛应用18。金属纳米复合材料可以有效提高金属纳米粒子催化活性。与金纳米晶体和金纳米杂化材料相比，钴具有不逊色的类氧化酶活性和超低的成本。Li 等19制备了石墨烯和功能化石墨烯量子点负载钴的纳米复合材料 Co-His-GQD-G 并应用于生鲜食品中毒死蜱的检测，其在灵敏度、快速性和稳定性等方面表现优异。但石墨烯载体的大规模应用还有一定的局限性。载体的选择对于提高钴纳米复合材料的催化活性非常重要。生物质炭具有较好的生物亲和性和丰富的多孔结构及较高的稳定性，是一种比普通石墨烯更具实用价值的纳米复合材料载体20。为了解决金属纳米粒子在载体上的分散和固定问题，同时提高金属纳米复合材料的稳定性和催化活性，本研究利用金属离子液体的溶解分散能力和对金属离子的固定作用，将梨瓜皮溶解分散于钴基水杨酸 N-丁基咪唑离子液体中，设计制备具有类氧化酶活性的钴生物质炭纳米复合材料人工酶。基于氯辛硫磷对钴生物质炭类氧化酶活性的抑制作用19，建立氯辛硫磷的比色检测方法，应用于农业土壤中氯辛硫磷残留的快速检测。1 实验部分 1.1 仪器与试剂日本 HITACHI 公司的 HITACHI S4800 扫描电子显微镜；日本电子株式会社的 2100F 场发射透射电子显微镜；北京普析通用仪器有限责任公司的 TU1901 双光束紫外可见分光光度计。3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）、氯化钴、N-丁基咪唑，购买自 Sigma-Aldrich 化学公司。其他所有试剂均为从国药集团化学试剂有限公司采购的分析级试剂。整个实验过程中使用的超纯水为Milli-Q 净化系统（18.2 Mcm1）生产。1.2 钴生物质炭制备将 80 mL 水杨酸（0.1 molL1）、80 mL N-丁基 96 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷咪唑（0.1 molL1）和 20 mL 氯化钴（0.1 molL1）的水溶液混合，70 搅拌 90 min，得到粉色混合液。然后用二氯甲烷进行萃取，将油相溶液旋转蒸发除去溶剂，85 真空干燥过夜，得到蓝色油状液体即钴基水杨酸 N-丁基咪唑离子液体18。梨瓜皮除去最外层表皮，用去离子水和无水乙醇分别清洗 3 次，除去可溶性无机盐和糖类，干燥后备用。将 3 g 干燥的梨瓜皮分散在 3 g 所制备的钴基水杨酸 N-丁基咪唑离子液体中，加水 500 mL，微波处理 30 min 后冷冻干燥。然后转移至管式炉，N2气氛中以 2 min1的速率升温至 900，保持 120 min，自然冷却至室温，得到钴生物质炭纳米复合材料。1.3 样品预处理从野外采集农业土壤样品，将 5 g 样品与 0.1molL1 PBS 缓冲溶液（pH 7.4，5 mL）和 1 mL 丙酮混合，超声 15 min，然后 10 000 rmin1离心 15 min，收集的液体用于氯辛硫磷检测。1.4 氯辛硫磷检测取 5 mgmL1钴生物质炭分散液（100 L）与不同浓度的氯辛硫磷标准溶液或样品溶液（200 L）混合，50 孵育 35 min，然后加入 300 L TMB 溶液（10 mmolL1）和 400 L 醋酸缓冲液（pH 4.0），摇匀后放置 3 min，然后在分光光度计上扫描光谱或测定 655 nm 波长处的吸光度。2 结果讨论 2.1 钴生物质炭人工酶合成钴生物质炭纳米复合材料人工酶的合成包括 3 个步骤。第一步是制备钴基离子液体。首先，N-丁基咪唑与水杨酸之间进行离子交换生成 N-丁基咪唑水杨酸盐离子液体。然后氯化钴与上述离子液体发生配位反应得到钴基水杨酸 N-丁基咪唑离子液体。上述反应中，1 个钴离子同时与 2 个水杨酸离子以配位键方式结合而形成稳定的钴基水杨酸阴离子。这种结合使不同钴离子得以彼此分隔，从而阻止了钴离子在还原过程中聚集形成较大的钴纳米粒子。第二步是梨瓜皮的溶解分散。利用离子液体对生物质的溶解能力，将梨瓜皮溶解分散在钴基水杨酸 N-丁基咪唑离子液体中。这种溶解分散作用使钴基离子液体在生物质前驱体的三维空间上达到均匀分布，对改善金属粒子与载体的分散性发挥了重要作用。第三步是热还原。混合浆液在 N2气氛中高温热解产生大量零价态钴原子，最终形成钴纳米粒子。采用 2 min1的缓慢升温速率持续热解，生物质炭化产生的气体会缓慢释放，可有效阻止钴离子在反应体系内的移动和聚集，有利于形成尺寸较小的钴纳米粒子。最终温度升至 900，并保持 2 h，高温处理使钴生物质炭复合材料进一步还原，这有利于催化活性的改善。此外，用 ICP-MS 测定复合材料中钴的质量分数为13.65%。2.2 结构表征采用 SEM、TEM 技术对所合成的钴生物质炭复合材料的结构与化学环境进行表征，结果见图 1。由图可知，钴生物质炭复合材料中含有丰富的孔隙和三维碳骨架。钴纳米粒子平均粒径为50 nm，均匀分布在生物质炭骨架上，具有优异的分散性，这一结果与元素映像分析结果一致（图 1d图 1g）。碳（C）、氮（N）、氧（O）和钴（Co）元素映 ab500 nm100 nm100 nm100 nm100 nm100 nmcdefg500 nm 图 1 钴生物质炭的 SEM(a)、TEM(bc)图像；碳(d)、氮(e)、氧(f)和钴(g)元素映像图 第 3 期曹志军，贺根和，张 凯，等：钴生物质炭人工酶的制备及其在土壤氯辛硫磷残留检测中的应用 97 像图揭示了各元素在复合材料中的空间分布。结果显示，Co 和 N 元素均匀地分布在碳骨架上，证明钴生物质炭复合材料具有极好的分散性。由于N 元素来自于梨瓜皮中的含氮结构和离子液体中的 N-丁基咪唑离子，Co 仅来源于钴基离子液体，证明离子液体对梨瓜皮有很好的溶解分散能力。2.3 类氧化酶活性氧化酶可以催化 TMB 氧化生成蓝色化合物，采用该反应作为模型反应，分别考察不同人工酶材料类氧化酶活性。结果如图 2 所示，在单独生物质炭存在下，显色体系为无色溶液，吸收光谱没有任何吸收峰，吸光度很小，说明单独生物质炭没有任何类氧化酶活性。在钴纳米粒子存在的情况下，显色体系呈浅蓝色，655 nm 处出现一个较强的吸收峰，说明钴纳米粒子具有显著的催化作用。在同样的条件下，与钴纳米粒子相比，钴生物质炭复合材料体系具有更大的吸光度，证明钴生物质炭的催化活性优于单独的钴纳米粒子。钴生物质炭上的钴元素被还原成了钴单质，说明钴纳米粒子与生物质炭的结合产生了明显的协同催化效应。钴生物质炭具有较高的类氧化酶活性是因为钴生物质炭对 TMB 和氧气具有一定的吸附作用，生物质炭的两亲性有利于 TMB 分子与氧气结合，能够促进氧气和 TMB 的充分接触，并提高电子转移效率。而且钴生物质炭表面的钴原子分散性好，从而表现出更高的催化活性。为了探究催化作用机理，分别考察钴生物质炭在氮气、空气和氧气的饱和溶液中对 TMB 的催化行为。从图 3 可知，氮气饱和溶液的吸光度接近于 0，说明在缺少氧气的条件下钴生物质炭不能催化 TMB 生成蓝色化合物。空气饱和溶液的吸光度明显高于氮气饱和溶液的吸光度，而氧气饱和溶液的吸光度则更高，说明氧气在反应中发挥着重要作用，也证明了钴生物质炭在 TMB 氧化反应中具有类氧化酶活性，可催化氧气氧化 TMB 生成蓝色的 TMB 氧化产物19。氮气00.20.4655 nm 处的吸光度0.60.81.0空气氧气 图 3 钴生物质炭催化不同气氛 TMB 溶液的情况 2.4 氯辛硫磷对催化活性的抑制为了研究氯辛硫磷对钴生物质炭人工酶活性的影响，将氯辛硫磷加入到钴生物质炭溶液中，50 孵育 30 min，通过测定 655 nm 处吸光度考察钴生物质炭对 TMB 氧化反应的催化能力。结果表明，加入氯辛硫磷后溶液吸光度明显下降（图 4），证明氯辛硫磷能有效地抑制钴生物质炭的类氧化酶活性。2.5 实验条件优化为了确定最佳反应条件，分别考察反应体系的 pH、反应时间、反应温度和人工酶用量对TMB 氧化反应的影响，结果如图 5 所示。图 5a 显示体系 pH 值不同，TMB 氧化反应效 55000.2cba0.40.60.8600650700750Absorbance/(a.u.)Wavelength/nm 图 2 钴生物质炭(a)、钴纳米粒子(b)和无金属生物质炭(c)催化体系的吸收光谱 98 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷率也不同，因为介质酸度会影响钴生物质炭的催化活性和 TMB 的反应活性。当介质 pH 为 4 时，体系吸光度达到最大，TMB 氧化反应效率最高。同时进一步考察反应时间对体系吸光度的影响（图 5b），当反应时间少于 35 min 时，反应体系吸光度随反应时间增加而迅速增大，当反应时间达到35 min 后，体系吸光度增大幅度变小。此外，对温度和催化剂用量对反应效率的影响进行分析（图 5c图 5d）。当反应温度低于 50 时，反应体系吸光度随温度升高而迅速增大，当温度超过 50 时，吸光度增加量逐渐变小。人工酶用量是影响 TMB氧化反应的重要因素，当人工酶用量低于 5 mgmL1时，随着催化剂用量的增加吸光度快速增长，当催化剂用量大于 5 mgmL1，吸光度的增加变缓。综合考虑提高灵敏度、减少分析时间和降低分析成本等的因素，确定最佳反应条件为：pH 4.0、反应时间35 min、反应温度50 和人工酶用量5 mgmL1。2.6 分析性能为了验证氯辛硫磷检测方法的可行性，分别测 55000.2ba0.40.60.8600650700750Absorbance/(a.u.)Wavelength/nm 图 4 对照组(a)和加入氯辛硫磷(b)的反应体系吸光度光谱图 10.200.360.520.680.8435反应体系的 pH 值79655 nm 处的吸光度00.160.320.480.640.8010203040655 nm 处的吸光度100.10.30.50.70.9304050602070655 nm 处的吸光度00.20.40.60.82468655 nm 处的吸光度(a)(b)(c)(d)反应温度/反应时间/min钴生物质炭的浓度/(mgmL1)图 5 介质 pH(a)、反应时间(b)、反应温度(c)和催化剂用量(d)与反应体系吸光度的关系曲线 第 3 期曹志军，贺根和，张 凯，等：钴生物质炭人工酶的制备及其在土壤氯辛硫磷残留检测中的应用 99 定反应体系在不同氯辛硫磷浓度下的吸收光谱和在 655 nm 处的吸光度，结果如图 6 所示。随着氯辛硫磷浓度的增加反应体系的吸光度下降，这是因为氯辛硫磷浓度越高，对钴生物质炭催化活性的抑制越强，导致氧化反应越慢，导致反应体系吸光度变低。当氯辛硫磷浓度在 0.0550 mol/L 范围内吸光度随氯辛硫磷浓度的增加而线性减小。相关线性回归方程为A=0.012 75 logCChlorphoxim+0.855 2，相关系数为 0.991 4。基于 3 倍的信噪比，测得本测定方法的检出限为 40 nmol/L。以 30 个相同浓度（500 nmol/L）的氯辛硫磷样品进行实验，验证检测方法的重现性。结果显示，检测结果的相对标准偏差为 4.16%，说明重现性较好。同时还探究 Ca2+、Mg2+、Na+、Fe3+、Zn2+、SO42、CO32、PO43和 C2O42 对选择性的影响（图 7），结果显示 1 mgmL1的上述离子对吸光度的影响小于 7%。以上结果证明，本方法具有较好的选择性，能够获得可靠的分析结果，可直接应用于农业土壤中氯辛硫磷的测定。本方法成本低、操作简单、读数直观，无需要繁琐的样品预处理，也不需要熟练操作人员使用昂贵仪器在固定的实验室中操作，检测时间较短，只需 35 min，检出限也明显低于现有方法。此外，本方法无需使用生物酶，所使用的钴生物质炭制备简单，易于储存，表明钴生物质炭在农业土壤中氯辛硫磷检测应用中具有明显的优势，呈现了在现场快速检测中的应用潜能。00.20.4655 nm 处的吸光度0.60.8对照组Ca2+Mg2+Na+Fe3+Zn2+SO42CO32PO43C2O421.0 图 7 加入不同离子反应体系的吸光度 2.7 农业土壤中氯辛硫磷加标回收测定为了进一步研究本比色测定法在农业土壤中氯辛硫磷残留量检测实际样品分析中的适用性，进行了土壤样本加标回收实验。从表 1 可知，回收率在 95.8%103.6%之间，在国家标准（GB/T274042008）允许的回收率范围内。此外，还采用气相色谱质谱联用（GC-MS）法检测样品中氯辛硫磷含量，测定结果与比色法测定结果基本一致，证明本方法具有较好的精度和重现性。本方法在土壤样品氯辛硫磷的快速检测中具有一定的应用前景。55000.20.40.60.801.0ab600650Wavelength/nm70075010.20.40.60.823450 mol/LAbsorbance/(a.u.)Absorbance/(a.u.)Log CChlorphoxin/(nmolL1)图 6 在 0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 mol/L 氯辛硫磷存在下反应体系的吸收光谱(a)和 655 nm 处的吸光度与氯辛硫磷浓度的关系曲线(b)100 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷 3 结论1）生物质炭对金属离子具有很好的固定作用，可以防止金属离子在还原反应和使用过程中发生团聚，实现金属粒子在钴生物质炭上的均匀分散。2）利用金属离子液体和生物质可以制备出具有高类氧化酶活性的金属纳米复合材料人工酶。3）基于氯辛硫磷对钴生物质炭氧化酶活性的抑制作用，可实现农业土壤中氯辛硫磷残留的快速检测。【参考文献】夏卫平.南方红壤区锥栗园水土流失防治技术实施探讨 J.亚热带水土保持,2020,32(4):30-31.1马中浩.南方红壤区玉米生育期坡地土壤抗侵蚀性特征 D.武汉:华中农业大学,2017.2马敬中,肖国斌,张涛,等.我国果蔬农药残留研究现状及安全措施 J.化学世界,2015,56(2):120-124.3符乃光,张俊清,刘明生,等.海南产益智等中药材中有机氯农药残留量的调查分析 J.中国热带医学,2005,5(2):352-352.4周瑶,张宇昊,马良,等.柑橘中农药残留检测技术研究进展 J.食品工业科技,2013,34(23):373-379.5王浦海,徐军.杀虫剂氯辛硫磷的合成 J.农药,1998,37(6):14-15.6范雅丽.我国蔬菜水果农药残留检测技术的发展与质量安全控制探讨 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