骨修复材料促成骨作用的分子机制.pdf

何飞，1993 年毕业于昆明医科大学，博士，主任医师，博士生导师。现任曲靖区域医疗中心院长，入选云南省云岭产业技术领军人才，云南省医学（骨科学）领军人才，云南省有突出贡献优秀专业技术人才，云南省中青年学术技术带头人，昆明市中青年学术技术带头人，享受云南省政府特殊津贴。担任教育部高等学校临床医学类专业指导委员会临床实践指导分委会委员等职。围绕干细胞与医用组织工程新材料和医学 3D 打印研究领域，先后主持国家自然科学基金 2 项、省级重大/重点等各类项目15 项，累计科研经费达 2000 余万元。以通讯作者、第一作者身份发表 SCI 收录论文、国家级核心期刊中英文论文 45 篇，主编专著 6 部，参编、参译 8 部，获得国家发明/实用新型专利/软件著作授权 15 项，获云南省科技进步三等奖 2 项，云南省卫生科技成果二等奖 1 项。骨修复材料促成骨作用的分子机制徐云容1），唐梓闻1），何飞2）（1）昆明医科大学第一附属医院骨科，云南 昆明650500;2）昆明医科大学附属曲靖医院骨科，云南 曲靖655000）摘要 MAPK、PI3K/AKT、AMPK、TGF-超家族、Wnt、Hippo、NF-B、Notch、JAK/STAT、Hedgehog、整合素、OPG/RANKL/RANK、HIF 等信号通路都与成骨分化相关，在骨修复材料促进成骨的过程中发挥着一定的调控作用，金属材料、无机材料、有机高分子材料和复合材料等骨修复材料可以通过激活一条或多条成骨相关信号通路促进骨组织再生。进一步了解骨修复材料促进成骨作用的相关分子机制将有助于骨修复材料更广泛地应用于骨组织工程和付诸临床实践，但目前关于骨修复材料促进成骨作用的具体分子机制还未彻底阐述清晰，未来仍需进一步研究。简要介绍现今与成骨分化相关的信号通路，综述骨修复材料在多种信号通路中的研究，为骨修复材料促成骨机制的深入研究提供借鉴。关键词骨修复材料；成骨；骨再生；信号通路中图分类号 R649.9 文献标志码 A 文章编号 2095 610X（2023）10 0168 12Molecular Mechanisms of Osteogenesis Promoted by BoneRepair MaterialsXU Yunrong1），TANG Ziwen1），HE Fei2）（1）Dept.of Orthopedic，The 1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，KunmingYunnan 650500;2）Dept.of Orthopedic，Qujing Affiliated Hospital ofKunming Medical University，Qujing Yunnan 655000，China）Abstract Signal pathways including MAPK，PI3K/AKT，AMPK，TGF-superfamily，Wnt，Hippo，NF-B，Notch，JAK/STAT，Hedgehog，integrin，OPG/RANKL/RANK，HIF，etc.are all related to osteo-genic differentiation and play a certain regulatory role in the process of bone regeneration promoted by bone repairmaterials.Bone repair materials such as metal materials，inorganic materials，organic polymer materials andcomposite materials can promote bone tissue regeneration by activating one or more signaling pathways relatedosteogenic.Further understanding of the molecular mechanisms underlying the promotion of osteogenesis by bone收稿日期20230518基金项目国家自然科学基金资助项目（8216090283）；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目（202101AY070001-013）作者简介徐云容（1997），男，云南曲靖人，在读硕士研究生，主要从事骨科基础研究工作。通信作者何飞，E-mail：昆明医科大学学报2023，44（10）：168179JournalofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20231007CN531221/Rrepair materials will help to broaden their application in bone tissue engineering and clinical practice.However，thespecific molecular mechanisms by which bone repair materials promote osteogenesis have not yet been fullyelucidated，and further research is still needed.This article briefly introduces the signal pathways related toosteogenic differentiation，summarizes the research on bone repair materials in various signal pathways，andprovides a reference for the in-depth study of the mechanism of bone repair materials in promoting osteogenesis.Key words Bone repair materials；Osteogenesis；Bone regeneration；Signaling pathways创伤、感染、手术、先天性畸形和肿瘤切除造成的骨缺损12，会导致骨不愈合、延迟愈合、连接中断或局部功能障碍3。而骨组织工程技术的发展，为骨缺损的修复与再生提供了诸多可能46，使人们对模拟天然骨所需材料的种类、化学组成、空间结构和生物特性有了很好的了解78。并且研究所产生的多种具有良好机械性能与生物相容性的骨修复材料在骨形成、骨诱导、骨传导、骨整合、组织再生中表现出了巨大潜能910。但骨形成是一个复杂、多阶段的生理过程，包含多种信号通路和细胞因子网络的相互交流11，关于骨修复材料是如何促进成骨作用具体机制的发掘与研究仍然有待深入。对于骨修复材料的进一步发展与临床应用，越来越需要详细了解其促进成骨作用的具体机制1213。本文针对现今研究较多的多种信号通路机制进行了一定的阐述，并进一步总结了骨修复材料促进成骨作用的相关分子机制，以期为骨修复材料促成骨作用分子机制的研究提供理论依据与新的思考。1成骨相关信号通路1.1RTK 信号通路RTKs 是一类酶联受体，其配体主要为各类生长因子，每一类 RTK 及其配体对应的都是一个蛋白家族，如其配体对应的 VEGF 包括 VEGF-A、VEGF-B、PGF 和 RTK 作 为 受 体 对 应 的 包 括HER1/2/3/4 的 EGFR 蛋白家族等。RTK 与配体结合后形成 RTK 二聚体发生自磷酸化，活化下游蛋白激活 MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路从而参与转录调控，见图 1，并最后影响成骨过程，其中成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）介导的信号通路就在成骨过程中发挥着重要作用14。1.2MAPK 信号通路MAPK 信 号 通 路 的 基 本 组 成 是 一 种 包 括MAPKKK、MAPKK、MAPK 的 3 级 激 酶 模 式，MAPK 分为 ERK、p38、JNK 和 ERK5 4 个亚族，其所构成的 ERK/MAPK、p38/MAPK、JNK/MAPK和 ERK5/MAPK 信号通路调节着细胞的生长和分化、对环境的应激、炎症反应等多种生理或病理过程，见图 1。MAPK 信号通路是成骨分化的重要机制，增加 ERK1/2、p38 和 JNK 的表达可以有效促进成骨分化基因的转录1518。1.3PI3K/AKT 信号通路PI3K 由一个催化亚基（主要为 p110）和一个调节亚基（p85）组成，既具有丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶活性，又具有磷脂酰肌醇激酶活性，可以将 PIP2 转化为 PIP3 活化 PDK1 从而激活参与细胞增殖与凋亡多种生理活动的 AKT，使 AKT对下游的 TSC1/2、FOXO、GSK-3 产生抑制作用和激活内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和 ATP 柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）进而调控转录，其在正向调控成骨细胞分化中可能起着主要的作用1921。1.4AMPK 信号通路AMPK 是一个由 亚基、亚基和 亚基组成的异源三聚体，主要被其上游的 LKB1 和CaMKK2 激活，见图 1，是生物能量代谢调节的关键分子22，并且在骨再生中也发挥着一定作用2324。1.5TGF-超家族信号通路TGF-超 家 族 成 员 包 括 TGF-、BMP、AMH、Activin、Nodal 及 GDF 等配体，主要涉及TGF-信号通路、BMP 信号通路、Activin 信号通路，见图 2，传导过程中配体与 II 型受体结合，II 型受体招募并磷酸化 I 型受体，I 型受体再使受体调节的 Smad（R-Smad）磷酸化以后与共同介导的 Smad（CoSmad）结合形成蛋白复合体转运至细胞核内调控转录，其对细胞的增殖、迁移、分化、凋亡起着广泛的调节作用。而在骨形成过程中TGF-信号通路对维持骨代谢平衡起着重要作用，可以促进成骨分化、抑制破骨细胞形成25，同时 BMP 信号通路对成骨分化的启动起着关键作用26。1.6Wnt 信号通路Wnt 信号通路包括 19 种 Wnt 配体蛋白，根据其受体不同，分为经典的 Wnt/-catenin 信号通路、非经典的 Wnt/平面细胞极性（planar cell pola-第 10 期徐云容，等骨修复材料促成骨作用的分子机制169rity，PCP）、Wnt/Ca2+和调节纺锤体的方向及非对称细胞分裂的胞内信号通路27。Wnt/-catenin信号通路具有高度保守性，在组织发育与再生中起着核心作用，通过调节细胞质转录因子-外界刺激整合素FAKRasTraf6Rac-1p85PIP2GFsRTKPI3KPDK1脂肪代谢CaMKK2LKB1P34S6KmTORC14E-PB1AMPKFOXOACLYAKTTSC1/2GSK-3糖代谢瘦素外界刺激Ob-Rbp110PIP3MAPKKKRafMEKK4/TAK1MEKK2/3MEK5MKK4/7MKK3/6MEK1/2ERK5JNK1/2/3p38ERK1/2c-junMEF2Elk-1MAPKKMAPK调控蛋白质代谢与细胞增殖图1RTK 通路、MAPK 通路、PI3K/AKT 通路、AMPK 通路、整合素通路并行示意图Fig.1ParalleldiagramofRTKpathway，MAPKpathway，PI3K/AKTpathway，AMPKpathwayandintegrinpathway箭头仅表示作用方向，MAPK 为丝裂原活化蛋白激酶，MAPKK 为 MAPK 激酶，MAPKKK 为 MAPKK 激酶，FAK 为局部黏着斑激酶，Ras 为 GTP 结合蛋白 Ras，Raf 为丝/苏氨酸蛋白激酶 Raf，MEK1/2/5 为 MAPK 激酶 1/2/5，ERK1/2/5 为细胞外调节激酶 1/2/5，Elk-1：细胞转录因子 Elk-1，Traf6 为泛素连接酶，Rac-1 为 GTP 结合蛋白 Rac-1，MEKK2/3/4 为MAPKK 激酶 2/3/4，TAK1 为转化生长因子 激酶 1，MKK3/4/6/7 为 MAPK 激酶 3/4/6/7，JNK1/2/3 为应激活化蛋白激酶 1/2/3，MEF2：细胞转录因子 MEF2，c-jun：细胞转录因子 c-jun，GFs 为各类生长因子，RTK 为受体酪氨酸激酶，PI3K 为磷脂酰肌醇 3 激酶，PIP2 为磷脂酰肌醇 2 磷酸，PIP3 为磷脂酰肌醇 3 磷酸，PDK1 为三磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1，AKT 为蛋白激酶 B，TSC1/2 为 GTP 结合蛋白 TSC1/2，mTORC1 为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 1，S6K 为蛋白激酶 S6K，4E-PB1 为转录结合蛋白 4E-PB1，GSK-3 为糖原合成酶激酶 3，FOXO 为细胞转录因子 FOXO，ACLY 为 ATP 柠檬酸裂解酶，Ob-Rb 为瘦素受体，CaMKK2 为钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶 2，LKB1 为丝/苏氨酸激酶 LKB1，AMPK 为AMP 依赖的蛋白激酶。TGF-/Activin/NodalBMP/AMH/GDFSmad2/3Smad2/3Smad2/3Smad2/3Smad4Smad4Smad4Smad7Smad6Smad1/5/8Smad1/5/8Smad1/5/8Smad1/5/8Smad1/5/8Smad2/3PPPP抑制抑制抑制I 型受体I 型受体II 型受体II 型受体靶基因靶基因图2TGF-超家族信号通路示意图Fig.2SchematicdiagramofTGF-superfamilysignalingpathway箭头仅表示作用方向，TGF-为转化生长因子，BMP 为骨形态发生蛋白，AMH 为抗缪勒管激素，Activin 为激活素，GDF 为生长分化因子，Smad1/2/3/4/5/6/7/8 为磷酸化细胞信号转导分子 1/2/3/4/5/6/7/8，P：磷酸化。170昆明医科大学学报第 44 卷catenin 是否磷酸化参与成骨细胞分化，见图 3，激活经典 Wnt 信号通路可以作为促进骨再生或加速骨愈合的一种有效方法，具有促进成骨和血管生成同时减少破骨形成的作用2830，并且其下游的 RhoA/ROCK 信号通路也在介导材料的不同微观形貌成骨中表现出了重要作用3132。FrizzledFrizzledWntLRPLRP激活态失活态降解TCFGSK-3GSK-3AxinAxinAPCAPCCK1CK1-catenin-catenin-catenin图3Wnt/-catenin 信号通路示意图Fig.3SchematicdiagramofWnt/-cateninsignalingpathway1.7Hippo 信号通路Hippo 信号通路是一条抑制细胞生长的通路，其下游效应因子为 YAP/TAZ，是调节间充质干细胞成骨分化的关键因子33。目前已有研究证明YAP/TAZ 信号通路和 Wnt 信号通路介导了材料微观形貌对细胞黏附和细胞骨架结构的调节，并最终影响成骨基因的表达34，但 Hippo 信号通路在是否有效促进成骨方面仍存在争议，其具体机制有待进一步深入研究35。1.8NF-B 信号通路NF-B 家族成员包括 NF-B1（p50）、NF-B2（p52）、RelA（p65）、RelB 和 c-Rel，其信号通路分为 IB 降解使 NF-B 二聚体（即 P50/P65复合物）得到释放转运至细胞核调控转录的经典信号通路，见图 4A，P100 或 P105 经加工处理成p52/RelB 二聚体转运至细胞核调控转录的非经典信号通路，见图 4B，以及 NF-B 介导的其他信号通路。NF-B 是细胞内重要的核转录因子，参与机体的炎症反应、免疫应答，调节细胞的凋亡、应激反应，并且通过其对炎症环境的调节可以有效参与成骨分化过程3637。1.9Notch 信号通路该信号通路的配体并不位于细胞外基质，而是位于与受体非同一细胞的细胞膜上，为 DSL 家族 蛋 白，目 前 为 止 包 括 JAG1、JAG2、DLL1、DLL3 和 DLL4，受体为 Notch 跨膜蛋白。Notch 受体与配体结合后，经过 ADAM 剪切释放胞外段与配体一同降解，经-secretase 剪切释放胞内段继续信号传导，激活 Hes/Hey 基因的转录26。目前已有研究表明 Notch 信号通路在成骨方面具有重要作用3840。1.10JAK/STAT 信号通路该信号通路的 JAK（酪氨酸蛋白激酶）包括JAK1/2/3、TYK，STAT（信号转导和转录激活子）包括 STAT1/2/3/4/6、STAT5A、STAT5B41，配体主要为 ILs、INFs，与受体结合后使受体发生二聚化，同时与受体偶联的 JAK 发生自磷酸化而活化，招募并磷酸化 STAT，使 STAT 形成二聚体进入细胞核调控转录，参与成骨细胞的分化3，同时也有研究表明其主要介导炎症反应在骨形成中发挥作用4243。1.11Hedgehog 信号通路Hedgehog（Hh）信号通路由 3 个配体 Shh、Dhh、Ihh 和 2 个跨膜蛋白受体 Ptc、Smo 及其下游 Gli、Fu、SuFu、Cos2、PKA 等转录因子组成。没有Hh 配体时，Ptc 抑制 Smo 蛋白活性从而抑制下游通路，Gli 与 SuFu 结合并被加工成 GliR，GliR 抑制靶基因转录；当 Hh 配体与 Ptc 结合时，解除对 Smo 的抑制作用，Smo 使 SuFu 与 Gli 解离，Gli 转变为 GliA，促进靶基因转录。Hh 信号通路在细胞增殖、组织形成、干细胞维持和发育的控制中具有多种作用。研究证明，Hh 信号通路的激活参与了 MSCs 向成骨细胞和软骨细胞的分化，可以通过上调 Runx2 等成骨细胞因子来促进骨量，在骨组织再生过程中起着关键作用4446。1.12整合素信号通路整合素是一个由 链和 链组成的异二聚体细胞跨膜蛋白家族47，包括 22 个不同的异源二聚体复合物，作为结合细胞外基质蛋白与细胞骨架之间信号的主要受体，允许间充质干细胞归第 10 期徐云容，等骨修复材料促成骨作用的分子机制171巢到骨以及可以加强成骨细胞和破骨细胞与细胞外基质之间的联系，可以与 ECM 结合触发整合素聚类，激活 FAK 等胞内信号蛋白，随后导致ERK1/2、p38、PI3K、AKT 等磷酸化，从而参与成骨分化4851。1.13其他信号通路OPG/RANKL/RANK 信号通路在破骨细胞的分化、激活和凋亡中起着至关重要的作用，OPG可作为破骨细胞的负调控因子，竞争性地与RANKL 结合，阻断 RANKL/RANK 信号通路，抑制破骨细胞分化参与骨代谢过程，也可能是骨修复材料促成骨过程中的一种潜在调控机制5253。也有文献报道缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor，HIF）信号通路也参与了血管生成和成骨调控49,54。2骨修复材料促成骨分子机制骨修复材料主要分为金属材料、非金属材料和复合材料 3 大类，其中非金属材料又可以分为无机材料和有机高分子聚合材料55。近些年骨修复材料在骨组织工程中的研究与应用越来越多，而针对其具体促成骨作用的分子机制研究还有待深入。2.1金属材料金属生物材料因其出色的机械力学性能、良好生物相容性及生物安全性而被广泛应用于骨缺损修复56。如锶在骨组织代谢中可以促进成骨细胞增殖，同时抑制破骨细胞的活性57，Cui 等58采用RT-qPCR 研究 Wnt/-catenin 信号通路相关基因（-catenin，DKK1，Wnt5A）和 Western blot检测-catenin 信号通路蛋白表达情况，同时采用 FH 535 阻断 Wnt/-catenin 信号通路以探究骨水泥中锶促成骨的可能分子机制，发现局部应用含锶骨水泥，可通过激活 Wnt/-catenin 信号通路促进骨再生。Zheng 等20将经非热大气等离子体（non-thermal atmospheric plasma，NTAP）处理的钛与 MC3T3-E1 细胞共培养，通过 qRT-PCR、Western blot 和免疫组化染色检测，PI3K 和 Akt蛋白表达显著上升，与未经处理的钛相比，NTAP 处理显著促进了基质矿化和钙结节形成，而在加入 PI3K 抑制剂 LY294002 的组 MC3T3-E1细胞在 NTAP 处理钛表面的黏附、增殖和成骨分化显然被抑制，说明 PI3K/AKT 信号通路在其中起着关键作用。He 等59采用阳极氧化制备了具有纳米管结构的多孔二氧化钛材料，结合 LC-MS/MS 质谱分析和富集分析利用 Western blot 检ATNF-TNFR1TLRCD40BAFFRLTRTAK1NIKIKKsIKKIBp50p50p50p65p65p100RelBRelBILsCD40LBAFFLT-B图4NF-B 信号通路示意图Fig.4Schematicdiagramof|NF-BsignalingpathwayA：NF-B 经典信号通路；B：NF-B 非经典信号通路。TNF-为肿瘤坏死因子-，ILs 为白介素，CD40L 为白细胞分化抗原 40 配体，BAFF 为 B 淋巴细胞活化因子，LT-为淋巴毒素-，TNFR1、TLR、CD40、BAFFR、LTR 分别为 TNF-、ILs、CD40L、BAFF、LT-对应的受体，TAK1 为转化生长因子-激活激酶 1，IKK 为 IB 激酶，IB 为 B 抑制蛋白，NIK 为 NF-B 诱导激酶。172昆明医科大学学报第 44 卷测发现 p-ERK1/2 的表达受到促进，整合素 1、p-JNK、p-p38、CTSK 和 TRAP 的表达受到抑制，RT-qPCR 检测显示 OCN、OPN、ALP 和 RUNX2显著上调，且当破骨细胞经 p-FAK 抑制剂处理后，p-FAK 的表达被抑制，同时破骨细胞标记蛋白CTSK 和 TRAP 的表达也相应地再次降低，研究结果证实，该材料可以通过整合素介导的 FAK 磷酸化及其下游 MAPK 通路抑制破骨细胞的形成，改变细胞因子的分泌情况，使其更有利于成骨。Zhang 等60研究了纳米钽的促成骨机制，发现纳米钽与骨髓间充质干细胞共培养和在 SD 大鼠下颌骨缺损修复过程中，BMP-2、Smad4 和Runx2 的 表 达 相 比 空 白 对 照 组 增 多，且 添 加Smad4 抑制剂后，ALP 表达、ECM 矿化和 Smad4细胞免疫荧光显著降低，表明 BMP/Smad 是金属钽促成骨作用的可能机制。也有实验证明，与钙离子具有相似离子半径的稀土元素也可以诱导骨组织生长，Ge 等61制备的含金属铈的复合材料中，释放的铈离子可以激活 BMP-2/Smad 信号通路，提高 BMP-2、OCN、Runx2 基因及成骨相关蛋白的表达水平促进骨组织再生。2.2无机材料无机材料主要包括羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥、生物活性玻璃等。羟基磷灰石作为骨组织的主要无机成分常被用做骨修复材料62，Guo 等7结合 RNA 测序和功能富集分析，发现羟基磷灰石与脐带间充质干细胞共培养所处的微环境中CDHs 和 ITGA2 的表达增加，说明其成骨作用与Hippo 信号通路和 PI3K/AKT 信号通路存在一定相关性，并且可能通过激活 TGF-信号通路，协同激活 ANXA10 依赖的 PTHrP 信号通路和 FGF信号通路，从而促进软骨内成骨，且脐带间充质干细胞高表达 TIMP1 和 TIMP3，表明 HIF 信号通路在其中也存在激活，而对于 OPG 表达的持续监测，揭示 OPG/RANKL 可能是羟基磷灰石成骨作用潜在调控途径的一部分，此外 SOX9、BMP 信号通路也存在激活，提示这一系列信号通路与羟基磷灰石促进成骨存在着密切的联系。Lu 等63通过数字光刻打印制备了圆柱型、回旋型、菱形孔 3 种典型结构的羟基磷灰石材料，RNA 测序显示 RhoA/ROCK2 信号通路相关基因的表达在各组间存在显著差异，Western blot 和 RT-qPCR 分析，DVL2、DAAM1、p-RhoA 和 p-ROCK2 上调明显，这些结果表明该材料通过增强 RhoA/ROCK2 通路的机械信号转导，促进了 BMSCs 向成骨分化。和成骨细胞一样，来源于单核细胞或巨噬细胞的破骨细胞同样是骨修复材料骨整合中的关键，Wang 等64通过改变磷酸四钙和无水磷酸二钙的比例制备不同钙磷比的磷酸钙骨水泥（calciumphosphate cement，CPC），通过表面等离子体共振分析，与钙磷比为 1.4 和 1.5 时相比，钙磷比为1.67 时 CPC 可以显著增强 RANKL 对 RANK 的亲和力从而促进破骨细胞分化，同时蛋白条带可视化和定量分析显示，钙磷比为 1.67 时 RANKL 诱导的 NF-B（p65）磷酸化显著上调，而 IB表达显著下调，意味着 1.67 钙磷比的 CPC 可以促进 IB 的降解从而增强 NF-B 信号通路的转导，揭示了高钙磷比 CPC（即钙磷比为 1.67 时的CPC）可以通过增强破骨细胞生成，促进 TGF-1 分泌加速骨愈合。生物活性玻璃属于第 3 代骨修复材料，十分有利于体外成骨细胞分化和矿化65，Yin 等66利用加入硼的生物活性玻璃（B-MBG）进行体内外实验，B-MBG 均表现出理想的成骨效果，RNA 测序 显 示 Wnt/-catenin 信 号 通 路 被 激 活，经Western blot 和 免 疫 组 化 验 证，-catenin、p-GSK-3 及靶蛋白 setd7（组蛋白赖氨酸甲基转移酶 7）表达增多，H3K4me3（组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化）变多，而在敲除 setd7 后，成骨相关标志物 ALP 和 Runx2 显著下降，表明 B-MBG 促成骨效应是由 Wnt/-catenin 信号通路介导 的，且 Setd7 和 H3K4me3 的 表 达 可 能 受 到Wnt/-catenin 信号通路的调控从而参与成骨促进。MEI 等67 制备了具有纳米结构的硅酸钙生物陶 瓷，qRT-PCR 检 测 成 骨 相 关 基 因 的 表 达，Runx2、OPN、Col1-1 显著上调，Western blot检测 FAK、p-FAK 和 MAPK 信号通路相关蛋白（ERK、JNK、p38）表 达 水 平，p-FAK、ERK、JNK、p38 表达水平明显上调，且在添加 FAK 信号通路抑制剂 PF573228 和 p38 信号通路抑制剂SB203580 时结果相反，表明硅酸钙生物陶瓷可以活化 FAK 激活 MAPK 信号通路促进成骨。2.3有机高分子材料与金属和无机材料相比，聚合物材料具有更多适应临床应用的物理化学性质，提供了更多的化学修饰和结构改变的可能性68，是极具前途的骨修复材料之一69。然而，有机高分子材料在大多数时候都是作为复合材料的基体70，使得缺少关于单一有机高分子材料促成骨作用相关分子机制方面的研究，未来可以优先考虑这一方面的探索。Li 等71通过体内外实验证明，负载去铁胺的明胶水凝胶可以激活 HIF1-信号通路，上调第 10 期徐云容，等骨修复材料促成骨作用的分子机制173eNOS、VEGF 和 SDF1-的表达，耦合成骨与血管化促进骨再生。ASPARUHOVA 等72利用qRT-PCR 和 Western blot，观察到在透明质酸处理的ST2 和 MC3T3-E1 细 胞 中 OPN、Col-1、Runx2、BSP、ALP 表达明显增加，Smad1/5/8 显著下调，TGF-1 和 FGF 显 著 上 调，Smad2 磷 酸 化 和Erk1/2 磷酸化增多，揭示透明质酸的促成骨作用是通过激活 TGF-/Smad2 和 Erk1/2 介导的信号通路实现的，但晚期同时表现为抑制 BMP/Smad信号通路。Han 等47采用3D 打印技术制备了氧化铁涂层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物骨修复材料，通过对整合素亚基 1、2、5、1、3 以及 FAK、ERK1/2 和成骨标志基因（OCN、Col-I、OPN、BMP2、ALP）的检测，发现该材料可以激活整合素信号通路，活化 FAK，上调 ERK1/2 促进成骨。聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）因其优异的力学性能和物理化学耐受性已被广泛用作骨修复材料73，Gao 等42采用 O2 等离子体处理PEEK 后，利用分层自组装技术制备了具有纳米孔结构的 PEEK 材料与骨髓间充质干细胞共培养，进行全基因组表达分析，发现其促成骨作用与MAPK 和 PI3K-Akt 信号通路介导炎症反应有关，为具有免疫调节能力新材料及其分子机制的研究提供了不同思路。Xue 等74研究了脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞在聚己内酯（polycaprolactone，PCL）材料上的成骨分化能力及可能机制，发现 PCL 对 3 种间充质干细胞都具有成骨促进作用，Western blot 检测，-catenin、p-Smad3 上调，且经-catenin 抑制剂DKK1、p-Smad3 抑制剂 SIS3 反向实验，发现抑制剂联合使用比单一使用显著降低间充质干细胞的成骨分化，证明 PCL 的促成骨作用是通过激活Wnt/-catenin 信号通路和 smad3 相关信号通路进行。Wang 等18研究表明，聚多巴胺作为一种涂层材料能有效促进成骨，在成骨分化验证实验中，免疫荧光染色显示聚多巴胺涂层组黏着斑蛋白（Vinculin）表达强度显著高于空白组，Westernbolt 检测 p-FAK、p-p38 表达增多，说明聚多巴胺涂层对 BMSCs 成骨分化的增强涉及 FAK/P38通路的激活。Sun 等75研究也表明聚多巴胺涂层可能通过激活 Wnt 信号通路、TGF-信号通路参与促骨生成。2.4复合材料为获得更佳的骨传导性、骨诱导性和骨形成效果及具有良好的机械性能与生物相容性的骨修复材料，对材料进行复合是一种研究新趋势76，并且针对复合骨修复材料促进成骨机制的研究成果卓著，见表 1。聚己内酯的疏水性和壳聚糖较差的力学稳定性，限制了他们在骨修复中的应用，而 Shi 等77将它们经溶剂铸造制成复合材料，结合前期 IL-10 敲除小鼠会发生骨质流失的研究成果，发现该材 料 通 过 增 加 外 胚 间 充 质 干 细 胞（ectoblastmesenchyme stem cells，EMSCs）中的 IL-10 水平激活 p38/MAPK 信号通路诱导抗炎反应促进成骨，在进一步使用 shRNA 特异性沉默 Hippo 信号通路中的关键分子 YAP 进行功能丧失实验后，发现EMSCs 中的矿化面积和碱性磷酸酶活性降低，该材料的机械性能可能使 YAP 产生响应进而调控成表1复合材料成骨机制的研究Tab.1Studiesonosteogenicmechanismofcompositematerials研究者发表年份材料生物相容性信号通路LEE等862023掺入了氧化锌/阿仑膦酸钠/BMP2纳米颗粒的细胞外基质/聚乳酸-羟基乙酸共聚物/改性后的氢氧化镁复合材料良好NO/cGMP和Wnt/-catenin信号通路SHI等772022聚己内酯/壳聚糖复合材料良好p38/MAPK和Hippo信号通路ZHANG等782022甲基丙烯酰壳聚糖/-磷酸三钙水凝胶良好Hippo信号通路WANG等792022还原性谷胱甘肽接枝甲基丙烯酸明胶所制备的抗氧化水凝胶良好PI3K/AKT信号通路XUE等802022壳聚糖季铵盐/氧化石墨烯/聚多巴胺复合材料良好BMP/Smads信号通路HUANG等162022钽/钛合金良好ILK/ERK1/2信号通路JIA等812021锌/锶合金良好Wnt/-catenin、PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路YANG等822021包含L-精氨酸和Ca2+的骨膜模拟助骨剂良好NO/cGMP信号通路CHENG等832021聚乳酸-羟基乙酸共聚物/-磷酸三钙复合材料良好MAPK和PI3K/AKT信号通路ZOU等852021负载甲状旁腺激素和纳米羟基磷灰石的壳聚糖/海藻酸钠水凝胶良好Notch信号通路FU等842019硫化铋/羟基磷灰石薄膜包裹的钛良好Wnt/Ca2+信号通路174昆明医科大学学报第 44 卷骨作用。Zhang 等78以甲基丙烯酰壳聚糖和-磷酸三钙进行光交联形成的复合水凝胶经实验证明可以上调碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白的表达，验证了 Hippo 信号通路在该材料促成骨的调控机制中发挥作用。Wang 等79将还原性谷胱甘肽接枝甲基丙烯酸明胶所制备的抗氧化水凝胶（GelMA-g-GSH）与 MC3T3-E1 细胞共培养，经过RNA 测序与富集分析，PI3K-Akt 信号通路明显上调，采用 qRT-PCR 与 Western blot 检测-catenin、GSK-3 和 PTEN 的表达水平，发现-catenin 基因和蛋白水平上调，PTEN 和 GSK-3基因和蛋白水平下调，并且在 GelMA-g-GSH 组中 最 明 显，而 在 使 用 了 PI3K 特 异 性 抑 制 剂LY294002 后，相关基因与蛋白表达水平与之前相反，表明 PI3K/Akt 信号通路是 GelMA-g-GSH促进成骨的潜在机制之一。Xue 等80实验证明MC3T3-E1 细胞在壳聚糖季铵盐/氧化石墨烯/聚多巴胺复合材料刺激 36 h 后，经 Western blot 检测BMP2、BMPR1B、BMPR2、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8和 Runx2 蛋白的表达水平升高，表明 BMP/Smads信号通路在 MC3T3-E1 细胞中参与了该复合材料促进成骨的过程。而将金属与金属复合，同样可以获得更好的成骨效果，Huang 等16选择金刚石和菱形十二面体作为单位细胞结构，利用激光熔融技术制备了钽/钛合金复合材料，其具有与骨小梁结构相似的优点，研究证明当大鼠骨髓间充质干细胞黏附在材料表面时，ILK 被 FAK 所募集并激活 ERK1/2，磷酸化的 ERK1/2 显著上调 Runx2 的表达水平，此外应用 U0126（ERK1/2 抑制剂）和 OSU-T315（ILK 抑制剂）可明显下调 Runx2 表达水平，进一步证实了 ILK/ERK1/2 信号通路介导了该材料的促成骨作用，且通过分组对比发现，具有金刚石单位细胞结构的钽/钛合金具有更加优异的生物性能和适当的机械强度。同样，Jia 等81合成的锌/锶合金材料，体内外实验表现出理想的成骨效果，经 RNA 测序和 Western blot 表明，该合金可以通过激活 Wnt/-catenin、PI3K/AKT 和 MAPK/ERK信号通路来促进成骨。Yang 等82不仅关注复合材料对成骨的影响，并且同时聚焦复合材料促血管化的作用，经体内外实验证明，他们制备的骨膜模拟助骨剂复合材料可以实现 L-精氨酸和 Ca2+的持续释放，激活NO（一氧化氮）/cGMP 通路，增强成骨与血管生成耦合效应促进骨组织再生，提示 cGMP 信号转导通路也潜在参与了骨形成的调控，可以深入研究。Cheng 等83所制备的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactide-co-glycolide），PLGA）和-磷酸三钙（-tricalcium phosphate，-TCP）复合材料在大鼠颅骨缺损模型免疫组化中显示，VEGF 表达显著增多，结合 Western blot 检测，发现 VEGF引发 Src、AKT、FAK 和 p38 下游磷酸化促进血管再 生 与 骨 形 成，表 明 MAPK 信 号 通 路 和PI3K/AKT 信号通路参与了该材料促成骨的作用，且进一步研究发现在材料中添