谷胱甘肽过氧化物酶基因重组乳酸菌的优化培养及其抗逆功能.pdf

食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.19.024基金项目：国家自然科学基金面上项目（31972050）作者简介：彭静静（1988），女（汉），博士研究生，研究方向：食品生物技术。*通信作者：王成华（1983），男（汉），副教授，研究方向：食品生物技术。谷胱甘肽过氧化物酶基因重组乳酸菌的优化培养及其抗逆功能彭静静，卢华娟，孙毓，刘辰星，王玲钰，岳世阳，方钰辉，刘小玲，王成华*（广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）摘要：为获取谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）基因重组乳酸菌 NZ9000/pNZ8148-GPx（简称 NG1）的最优生长条件和在模拟胃肠道环境下的抗逆性情况，采用单因素试验和响应面分析法优化 NG1 的生长条件，同时对该重组菌的体外抗 H2O2、抗胆汁酸盐和抗酸胁迫能力进行研究。结果表明，NG1 的最优生长条件为培养温度36 益、初始 pH7.6、Na2SeO3浓度 59 滋g/mL；NG1 对各胁迫因素的最高耐受值分别为过氧化氢（H2O2）1.5 mmol/L、胆汁酸盐 0.20%、酸度 pH6.0；耐受能力排序为优化培养 NG1常规培养 NG1常规培养 NG0（NZ9000/pNZ8148），说明GPx 基因的导入对乳酸菌的抗 H2O2和胆汁酸盐胁迫功能有增强作用，且在最优培养时得到强化，但对酸度耐受性无明显增强作用。关键词：乳酸菌；乳酸乳球菌；谷胱甘肽过氧化物酶；生长条件优化；耐受试验；抗逆功能Optimization of Growth Conditions and Analysis of Stress Resistance forGlutathione Peroxidase Recombinant Lactic Acid BacteriaPENG Jingjing，LU Huajuan，SUN Yu，LIU Chenxing，WANG Lingyu，YUE Shiyang，FANG Yuhui，LIU Xiaoling，WANG Chenghua*（College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China）粤遭泽贼则葬糟贼：To obtain the optimal growth conditions for the glutathione peroxidase（GPx）recombinant lactic acidbacteriaNZ9000/pNZ8148-GPx（NG1）andassessitsstressresistanceundersimulatedgastrointestinalconditions，single-factor experiments and response surface analysis were conducted for optimizationof growth conditions forNG1.Additionally，the in vitro resistance of the recombinant strain to H2O2，bile salts，and acid stress wasstudied.The results showed that the optimal growth conditions for NG1 were as follows：cultivation temperatureof 36 益，initial pH7.6，and Na2SeO3concentration of 59 滋g/mL.The highest tolerance values of NG1 to variousstress factors were 1.5 mmol/L for H2O2，0.20%for bile acid salts，and pH6.0 for acidity.The tolerance rankingwas as follows：NG1 under optimal cultivation NG1 under conventional cultivation NG0（NZ9000/pNZ8148）under conventional cultivation，indicating that the introduction of the GPx enhanced the stress resistance of thelactic acid bacteria to H2O2and bile acid salts，especially under optimal cultivation conditions.However，therewas no significantenhancement ofacidtolerance.运藻赠 憎燥则凿泽：lactic acid bacteria；Lactococcus lactis；glutathione peroxidase（GPx）；growth optimization；toler原ance test；stress resistancefunction引文格式：彭静静，卢华娟，孙毓，等.谷胱甘肽过氧化物酶基因重组乳酸菌的优化培养及其抗逆功能J.食品研究与开发，2023，44（19）：165-171.PENG Jingjing，LU Huajuan，SUN Yu，et al.Optimization of Growth Conditions and Analysis of Stress Resistance forGlutathione Peroxidase Recombinant Lactic Acid BacteriaJ.Food Research and Development，2023，44（19）：165-171.生物工程165食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期如何通过便利而经济的生产方式得到有机硒或单质硒已成为近些年的研究热点1。本课题组前期通过基因工程方法构建了一株谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）基因重组乳酸菌 NZ9000/pNZ8148-GPx（简称 NG1），利用了微生物廉价易得、方便培养、生长较快、产率较高的优势。虽然无机形态的Na2SeO3通过微生物的内部代谢可转化为有利于人体吸收的成分2，但高浓度的 Na2SeO3会影响菌株的正常生长3；因 NG1 应用了乳酸菌中最具代表性的乳酸链球菌素诱导控制的基因表达系统（nisin-inducible con-trolledgene expression，NICE）4，故乳酸链球菌素（Nisin）的诱导量是影响菌株发酵生产力的重要因素5；再者，每种细菌都有最适合自身生长的温度和 pH 值6，而pH 值是乳酸菌在发酵生产上得以应用的重要影响因素7。因此，以上 4 个因素的优化问题将成为 NG1 工程菌得以开展后续发酵和应用研究的前提。因乳酸菌具有富硒能力8，而益生菌富有维持肠道菌群生态平衡、抑菌、抗氧化等益生功能，故富硒乳酸菌具有益生菌和补硒的双重功效9。Fuller10最早提出了“最好的菌种来源是分离自同种动物的胃肠道”的观点。鉴于动物胃内高胆盐、强酸性的环境，势必要求益生菌种具备相应的抗逆功能。由于谷胱甘肽过氧化物酶本身具有抗氧化、抗炎等作用11-12，本试验所用GPx 重组乳酸菌有望成为集乳酸菌、乳酸菌代谢物和谷胱甘肽过氧化物酶三者优势于一体的新菌株。通过NG1 菌株体外的 H2O2、胆盐和酸度耐受试验可评估其抗逆功能；通过与未导入 GPx 基因的重组乳酸菌NZ9000/pNZ8148（简称 NG0）的对比，可判断外源 GPx基因的导入对乳酸菌抗逆性能的影响。总之，本文对GPx 基因重组乳酸菌 NG1 的培养温度、初始 pH 值、Na2SeO3浓度和 Nisin 浓度 4 个生长条件进行优化，并对其体外抗逆功能指标进行分析，以期为后续发酵生产以及定殖于人体胃肠道内的研究提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株乳酸菌 NG1：广西大学轻工学院食品生物技术实验室保存的 NZ9000/pNZ8148-GPx 重组乳酸菌；乳酸菌 NG0：广西大学轻工学院食品生物技术实验室保存的 NZ9000/pNZ8148 重组乳酸菌。1.1.2试剂牛肉粉、酵母浸粉、大豆胨、蛋白胨、酪蛋白胨、茁-甘油磷酸钠、抗坏血酸钠、硫酸镁（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；氯霉素、乳酸链球菌素（均为生物级）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亚硒酸钠（生物级）：美国 Sigma-Aldrich 公司；胆汁酸盐（生物级）：大连美仑生物技术有限公司；30%过氧化氢（优级纯）：天津市大茂化学试剂厂。1.2仪器与设备pH 计（A111）：美国 Thermo Fisher Scientific 公司；立式自动压力蒸汽灭菌器（GI80TW）：厦门致微仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2F）：苏州安泰空气技术有限公司；酶标仪（M200 PRO）：瑞士 TECAN 公司；超纯水机（Mili-QAdvantageA10）：美国 Millipore 公司；振荡培养箱（ZQZY-85CS）：上海知楚仪器有限公司；电热恒温培养箱（DHP-9082）：上海齐欣科学仪器有限公司。1.3方法1.3.1培养基和试剂的配制1.3.1.1培养基的配制M17 培养基：5 g/L 牛肉粉、2.5 g/L 酵母浸粉、5 g/L大豆胨、2.5 g/L 蛋白胨、2.5 g/L 酪蛋白胨、19 g/L 茁-甘油磷酸钠、0.5 g/L 抗坏血酸钠和 0.25 g/L 硫酸镁，pH7.07.4。配制固体平板时在此基础上加 15 g/L 琼脂粉。各成分按照比例加入后用蒸馏水定容至所需体积，并经103.4 kPa、115 益高压灭菌 20 min 后使用。GM17 培养基：将已灭菌冷却的葡萄糖和 M17 培养基混合，使葡萄糖终浓度为 0.5%。GM17（Cr+）培养基：添加了氯霉素（终浓度为12.5 滋g/mL）的 GM17 培养基。1.3.1.2试剂的配制25 mg/mL 氯霉素：将氯霉素按配比溶于无水乙醇中，过膜除菌，冻藏待用。100 mg/mL Na2SeO3：将 Na2SeO3按配比溶于无菌超纯水中，过膜除菌，冻藏待用。100 滋g/mL Nisin：将Nisin 按配比溶于 0.05%醋酸中，过膜除菌，冻藏待用。1.3.2菌株的常规活化培养取实验室保存的 NG1 和 NG0 原始菌种，均采用分区划线法接种于 GM17（Cr+）平板上，30 益、过夜静置培养；挑取单菌落并接种至 GM17（Cr+）液体培养基中，装液量为 7 mL/30 mL 直型瓶，30 益、过夜静置培养，活化 2耀3 代后即可作为菌液使用。1.3.3生长曲线的测定以 1%接种量将活化后的 NG1 菌液接种于 GM17（Cr+）液体培养基中，装液量为 100 mL/250 mL，30 益静置培养 24 h；每隔 2 h 取样测定一次发酵液中乳酸菌 NG1 在 600 nm 处的吸光值（OD600值）；以菌株培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。1.3.4生长条件的单因素优化试验以 GM17（Cr+）为基础培养基，分别考察培养温度（30、35、37、40 益）、液体培养基的初始 pH 值（3.0、4.0、生物工程166食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0）、Na2SeO3浓度（0、20、40、60、80、100、120 滋g/mL）、Nisin 浓度（0、1、5、10、20、30、40、50 滋g/mL）对乳酸菌 NG1 生长的影响，即通过该菌株培养至对数生长后期（即按 1%接种量扩培后养菌至 18 h）能达到的最大 OD600值来获取最优的单因素培养条件。1.3.5响应面法优化培养条件在单因素试验的基础上，选取对乳酸菌 NG1 生长影响较显著的三因素三水平，继续以培养温度（A）、初始 pH 值（B）和 Na2SeO3浓度（C）为考察变量，以菌液OD600值（Y）为响应值，并通过 Design-Expert 8.0.6 软件的 Box-Behnken 设计完成响应面分析试验13-14。因素水平见表 1。1.3.6体外耐受试验用 30%H2O2原溶液及其稀释液配制含 H2O2浓度分别为 0、0.1、0.4、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0mmol/L 的 GM17（Cr+）液体培养基；配制含胆汁酸盐浓度分别为 0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%的GM17（Cr+）液体培养基；用 1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 分别调配 pH 值为 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 的GM17（Cr+）液体培养基。分别取以上 3 种模拟胃肠道极端环境15的培养基 200 滋L 于酶标板孔中，将 NG1 以 1%的接种量完成接种，做两组平行；30 益静置胁迫培养约 18 h，测定菌液对数后期的 OD600值；以 NG0 为空白对照，同时以响应面试验筛选出的最优生长条件胁迫培养 NG1作为对照组。1.3.7菌体耐受能力测定测定不同胁迫条件下的菌液对数生长后期（即按1%接种量扩培后养菌至 18 h）的 OD600值，计算菌种不同胁迫条件下的耐受能力，公式16如下。N=（X/K）伊100式中：N 为耐受能力，%；X 为胁迫条件下菌液的OD600值；K 为空白培养基的 OD600值。2结果与分析2.1生长条件的单因素优化结果培养温度、初始 pH 值、Na2SeO3浓度和 Nisin 浓度对乳酸菌 NG1 的生长影响如图 1 所示。由图 1a 可知，在 14 h 前，乳酸菌 NG1 在 37 益的培养温度下生长略有滞后，40 益下生长明显滞后；30 益和 35 益条件下生长趋势比较一致；但培养至 18 h 时，表 1响应面试验因素和水平Table 1Factors and levels of response surface method水平因素A 培养温度/益B 初始 pH 值C Na2SeO3浓度/（滋g/mL）-1357.0200377.5401408.0600.70.60.50.40.30.20.100226培养时间/h4640 益37 益35 益30 益8 10 12 14 16 18 20 22 24a0.60.50.40.30.20.100226培养时间/h468 10 12 14 16 18 20 22 24b10.09.08.07.07.56.56.05.55.04.03.00.80.70.60.50.40.30.20.10040培养时间/h5101520253035c120 滋g/mL100 滋g/mL80 滋g/mL60 滋g/mL40 滋g/mL20 滋g/mL0 滋g/mL0.70.60.50.40.30.20.10044培养时间/h4812 16 20 24 28d50 滋g/mL40 滋g/mL30 滋g/mL20 滋g/mL10 滋g/mL5 滋g/mL0 滋g/mL32 36 40a.培养温度；b.初始 pH 值；c.Na2SeO3浓度；d.Nisin 浓度。图 1不同培养温度、初始 pH 值、Na2SeO3浓度、Nisin 浓度下乳酸菌 NG1 的生长曲线Fig.1NG1 growth curves under different temperatures，pHvalues，Na2SeO3concentrations，and Nisin concentrations1 滋g/mL生物工程167食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期37 益培养的菌体在对数末期的 OD600值最大。故确定NG1 的最适生长温度为 37 益。由图 1b 可知，乳酸菌 NG1 在 pH3.0 和 pH4.0 条件下生长被严重抑制；随着培养基初始 pH 值升高，NG1生长状况越来越好；至 pH7.5 时，NG1 生长速率和OD600值均为最高，在 18 h 也是最高值；而 pH 值高于 7.5后，随着碱度增大，菌体生长速率逐渐减缓；在 pH 值为10.0 的培养基中，NG1 也能正常生长。综上，pH7.5 为NG1 的最适生长初始 pH 值，且 NG1 适宜生长培养基为弱碱性，即菌体对碱性环境的耐受能力强于酸性环境。由图 1c 可知，前 20 h 内，不同 Na2SeO3浓度（0耀120 滋g/mL）对乳酸菌 NG1 的生长影响整体呈抑制趋势，但相对于其它组，40 滋g/mL 的富硒浓度下 NG1 生长状况最好；故确定 NG1 最适生长的 Na2SeO3浓度为40 滋g/mL。这比乳杆菌株 JZ-0717和鼠李糖乳杆菌ATCC 5310318的最佳富硒诱导剂量 10 滋g/mL 高，但与布氏乳杆菌 922-1119的最佳富硒诱导剂量 43耀46滋g/mL相近。由图 1d 可知，Nisin 的加入量为 0耀50 滋g/mL 时对NG1 生长影响不明显，生长趋势大体一致，OD600值也相差不大。因此，Nisin 浓度不作为后续响应面优化和验证的考察因素。2.2响应面试验设计结果与分析2.2.1响应面试验的设计与方差分析NG1 生长条件的响应面设计分析结果见表 2。对表 2 数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程为 Y=0.76-0.15A+0.071B+0.073C+0.055AB+0.12AC+0.052BC-0.10A2-0.12B2+0.046C2。对上述回归模型进行方差分析，结果见表 3。表 3 结果表明：模型 P=0.001 60.01，失拟项 P=0.107 9跃0.05，说明模型显著；判定系数 R2=0.940 5，接近于 1，即实际值和预测值接近，说明模型拟合性较好；调整判定系数 R2Adj=0.864 0，说明该模型能够解释86.40%试验数据的变化；变异系数为 9.46%（10%），说明模型的可信度和精确度较高。因此，可用此模型分析与预测 NG1 在不同条件下的生长状况。一次项 A、交互项 AC、二次项 B2影响极显著（P0.01）；一次项 B和 C、二次项 A2影响显著（P0.05）。2.2.2响应面的交互作用分析培养温度、初始 pH 值、Na2SeO3浓度 3 个因素两两之间交互作用的响应面图如图 2 所示。表 2NG1 生长条件优化响应面试验设计与结果Table 2Design and result of response surface method forgrowth condition optimization of NG1序号因素OD600值A 培养温度B 初始 pH 值C Na2SeO3浓度预测值实际值1-1-100.680.7121-100.270.213-1100.710.7741100.520.495-10-10.910.84610-10.360.387-1010.810.7981010.750.8290-1-10.600.641001-10.640.65110-110.640.63120110.890.85130000.760.71140000.760.82150000.760.76160000.760.79170000.760.74表 3模型回归方程方差分析Table 3Variance analysis of regression model方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型0.46090.05112.290.01*A0.18010.18043.960.001*B0.04110.0419.750.05*C0.04210.04210.100.05*AB0.01210.0122.910.132 0AC0.06010.06014.420.01*BC0.01110.0112.650.147 7A20.04410.04410.520.05*B20.05810.05813.84常规培养 NG1常规培养 NG0，说明 GPx 基因的导入对乳酸菌的抗 H2O2和胆汁酸盐胁迫功能有增强作用，且在最优培养条件下得到强化，但对酸度耐受性无明显增强作用。据悉，人体小肠液因含有胰蛋白酶、胆汁酸等，其 pH 值约为 7.6，胆汁酸盐质量分数在 0.03%耀0.3%之间波动27。故肠道 pH 值并不是乳酸菌进入消化道发挥作用的阻碍因素，更多的是胰蛋白酶和胆汁酸盐的存在影响了乳酸菌的生长28。而人体胃液 pH 值在空腹和进食后在 0.9耀5.0 之间波动。故胃液的强酸环境才是胁迫乳酸菌生长的主要因素。因此，乳酸菌 NG1 一定程度上具备了食用价值和定植于肠道的潜能。3结论本研究采用单因素试验和响应面分析法优化 GPx基因重组乳酸菌 NG1 的生长条件，确定了 NG1 的最适生长条件为培养温度 36 益、初始 pH7.6、Na2SeO3浓度 59 滋g/mL。此外，通过 3 项模拟胃肠道环境的体外抗逆功能研究，确定了 NG1 对各胁迫因素的最高耐受值为 H2O21.5 mmol/L、胆汁酸盐 0.20%、pH6.0。由于耐受能力排序为优化培养 NG1常规培养 NG1常规培养 NG0，说明 GPx 基因的导入对乳酸菌的抗 H2O2和胆汁酸盐胁迫功能有增强作用，且在最优培养条件下得到强化，但对酸度耐受性无明显增强作用。综上所述，该研究结果表明 NG1 具有被食用和定植于肠道的极大潜能，同时可为更多来源的硒蛋白及富硒乳酸菌的基础研究及其在食药方面的市场应用提供重要参考。表 6NG1 在不同酸度下的耐受力Table 6Tolerance of NG1 in different acidity0.900.800.700.600.500.400.300.200.1000 0.16.0H2O2浓度/（mmol/L）0.4 0.7a1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0优化培养NG1NG1NG00.80.70.60.50.40.30.20.1000.30胆汁酸盐浓度/%0.05b0.100.150.20优化培养NG1NG1NG00.6000.5000.4000.3000.2000.100026pH 值3c45优化培养NG1NG1NG0a.H2O2浓度；b.胆汁酸盐浓度；c.酸度。图 4NG1 在不同浓度 H2O2、胆汁酸盐及不同酸度下的生长OD600值Fig.4Growth OD600of NG1 at different concentrations of H2O2，bile acid salts，and acidity生物工程170食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期参考文献：1杨靖鹏,宋云博,李俊娥,等.乳酸菌富硒能力及其体外生物活性评估J.中国食品学报,2019,19(1):171-182.YANG Jingpeng,SONG Yunbo,LI June,et al.Selenium-enrichedlactic acid bacteria and evaluation of their bioactivities in vitroJ.Journal of Chinese Institute of Food Science and 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