宫颈高危型HPV感染者外周血T细胞亚群及其免疫因子变化分析.pdf

na)2023年6 月第2 7 卷第6 期669中国实验诊断学(9076):485.8JFeng W,Liu GF,Qin JB.Ginkgo biloba Damo injection combinedwith troxerutin regulates the TLR4/NF-kB pathway and pro-motes the recovery of patients with acute cerebral infarctionJJ.American Journal of Translationl Reserrch,2021,13(4):3344.9张颖.无创产前基因检测的临床应用及遗传咨询 J.中国计划文章编号：10 0 7 42 8 7（2 0 2 3)0 6 0 6 6 90 5生育学杂志，2 0 17，2 5（12）：8 0 9.1oJLiang D,Cram DS,Tan H,et al.Clinical utility of noninvasiveprenatal screening for expanded chromosome disease syndromesJJ.Genet Med,2019,21(9):1998.（收稿日期：2 0 2 2 0 8-2 3）宫颈高危型HPV感染者外周血T细胞亚群及其免疫因子变化分析余晓凤，曹德琦，徐晓明，姜岩松，王晶华（承德市中心医院检验科，河北承德0 6 7 0 0 0）摘要：目的研究宫颈高危型HPV感染者外周血T细胞亚群及其免疫因子变化及其临床意义。方法法收集宫颈高危型HPV-DNA阳性148 例为病例组，其中CINI41例，CINI 38 例，CIN38 例，宫颈鳞癌（SCC)31例；同时选取高危型HPV-DNA阴性健康者40 例为对照，检测各组外周血T细胞亚群及血清中免疫因子含量，分析各组之间差异。结果与对照组相比，随着宫颈病变进展,CINI、CI NI、CI N及SCC组外周血 CD4+T细胞比例含量逐渐减低，CD8+T细胞比例逐渐升高，CD4+/CD8+比例逐渐减低，差异有统计学意义（P0.05）。H P16/18 型与其他型别感染组相比，血清IFN-含量逐渐减低，IL-4、IL-17 及TGF-1含量逐渐升高，差异有统计学意义（P0.05）。结论宫颈高危型HPV感染伴宫颈病变患者及宫颈鳞癌患者体内存在不同程度的细胞免疫减低，检测T细胞亚群及其免疫因子变化可用于进一步研究宫颈高危型HPV感染的免疫机制，为临床高危型HPV感染伴宫颈病变免疫干预及预后提供客观依据。关键词：高危型HPV；宫颈上皮内瘤变；T细胞亚群；细胞因子中图分类号：R711.74文献标识码：AYU Xiao-feng,CAODe-Analysis of T cell subsets and immune factors in peripheral blood with high-risk HPV infectionqi,XU Xiao-ming,et al.(Clinical Laboratory,Chengde Central Hospital,Chengde 067000,ChiAbstract:Objective To analyse the changes of T cell subsets and immune factors and its clinical significance in pe-ripheral blood of patients with high-risk HPV infection in the cervix.Methods 148 cases with high-risk HPV-DNApositive were collected including 41 cases of CIN I,38 cases of CIN II,38 cases of CIN II and 31 cases of squamouscell carcinoma(SCC);Meanwhile,40 cases with high-risk HPV-DNA negative of healthy people were selected as thecontrol group.Detecting the level of the T cell subsets and immune factors in peripheral and the differences were ana-lysed among the groups.b Results Compared with the control group,with the progress of the pathological staging,thelevel of CD4+T cells were decreased gradually in groups of CIN I,CIN II,CIN II and SCC;CD8+T cells were in-creased gradually,the ratio of CD4+/CD8+were decreased gradually,the differences were significant(P0.05).Thetrend of the changes for immune factors with hish-risk HPV infection in other types was consistent with HPV16/18.Compared with the control group,the content of IFN-were decreased gradually,IL-4,IL-17 and TGF-1 were in-creased gradually among the four groups,the differences were significant(Po.05).Conclusion Cell-medicated immu-nity decreased in patients with high-risk HPV infection for high grade cervical lesions and squamous cell carcinoma ofthe cervix,detecting the changes of T cell subsets and immune factors can be used to further study the immune mecha-nism of high-risk HPV infection of cervix,and provide objective basis for the immune intervention and prognosis of clin-ical high-riskHPVinfection.Key words:High-risk HPV;Cervical intraepithelial neoplasia;T cell subsets cytokines(ChinJ LabDiagn,2023,27:0669)Chin J Lab Diagn,June,2023,Vol 27,No.6670宫颈癌（cervical cancer,CC)发病率居女性生殖系统恶性肿瘤第一位，近年来有发病率及死亡率升高和发病人群年轻化的特征，对女性的生命健康造成严重威胁 1-2 。宫颈高危型HPV感染与宫颈癌前病变及宫颈癌密切相关，研究发现在约99%的宫颈癌中能够检测到高危型HPV感染 3-4。大约有80%的宫颈癌是由HPV16型和HPV18型感染所致 5。其中绝大部分表现为一过性感染，大多数病损能够自行消退。有相关数据显示 6 ，在两年内有约90%的HPV感染能够进行自我清除，能发展为恶性肿瘤的HPV感染不足1%7。由此说明宿主自身免疫调节在抗HPV感染中发挥关键作用。干扰素-（Interferon-，I FN-）和白介素-4（Interleu-kin-4,IL-4)分别是Thl、T h 2 细胞分泌的具有代表性的细胞因子，在机体的正常生理状态下，Thl、T h 2处于动态平衡状态，而HPV持续感染引起的特定细胞所介导的免疫反应会破坏这种平衡，导致宫颈上皮内病变甚至肿瘤的发生 8 。Th17细胞是独立的CD4+T细胞亚群，可合成并分泌促进炎症反应发生的细胞因子 IL-17;Treg细胞是调节性T细胞，具有强大的免疫抑制功能 9，其分泌的转化生长因子-1（t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r-l,TGF-1)主要参与细胞分化、增殖等多种病理生理过程，在肿瘤发展中具有双重作用 10 。研究发现 11，Th17/Treg 细胞比例失衡在炎症反应、自身免疫性疾病以及恶性肿瘤的发生中起重要介导作用。本研究旨在探讨Th1/Th2、T h 17/T r e g 细胞分泌相关细胞因子与宫颈高危型HPV感染的关系，旨在进一步揭示宫颈病变与SCC发病机制，从而为临床高危型HPV感染的免疫干预及预后提供客观依据。1材料与方法1.1材料1.1.1研究对象选取2 0 2 0 年5月至2 0 2 1年12月于承德市中心医院妇科门诊及病房行宫颈癌筛查的患者，高危型HPV-DNA检测阳性且分别行TCT检查及阴道镜下病理活检者共148 例为病例组，其中CINI41例，CINI38例，CIN38 例，宫颈鳞癌（SCC)31例；同时选取高危型HPV-DNA阴性健康者4o例为对照组（Control Group,CG)。纳人标准：年龄：2 1-6 5岁；高危型HPV感染：16 型，18型，其他12 种高风险亚型：31，33，35，39，4551，52,56，58，59，6 6 和6 8 型。排除标准：妊娠或哺乳期的女性患者；近1年内使用过免疫抑制剂或增强剂治疗，且伴有免疫性疾病者；经血清学或PCR法证实伴有其他病毒感染性疾病者；有重要脏器的器质性病变者；精神疾病患者；近半年内有重大手术、创伤等应急刺激者；近2 月接受全身抗病毒治疗者；患有除宫颈癌以外的其他恶性肿瘤者；处于生殖道急性感染期者；双重或多重高危型HPV感染者。1.1.2主要试剂和仪器由贝克曼库尔特有限公司提供的四色淋巴细胞亚群剂：CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5（PN.6 6 0 7 0 13）C D 45-FITC/CD16CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5(（PN.6607073)；溶血素（OptilyseC,PN.A11895)；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司，FC500）；酶标仪(型号：MultiskanFC)。1.2方法1.2.1病例组分组严格按照纳人及排除标准将高危型HPV-DNA检测阳性，有宫颈病变且根据宫颈多点活检及P16/Ki67双染结果判定病变级别分为 CINI组、CINI组、CINI组及 SCC组。1.2.2IHPV核酸分型检测(1)标本采集：使用专用宫颈刷在宫颈鳞-柱状上皮交界处轻轻刷取数圈，获得宫颈脱落细胞，放人保存液中及时送检。（2)检测方法：使用罗氏cobas4800全自动核酸提取及实时荧光定量PCR分析系统对标本行HPV核酸检测及分型。1.2.3淋巴细胞亚群检测（1）标本采集：对符合标准的患者，在获取其知情同意的情况下采集空腹静脉血2 ml,EDTA抗凝。（2)实验操作：取流式管2只，将每个病人的样本管分别标记为A管和B管，用加样枪分别吸取10 l四色淋巴细胞亚群试剂于A管（CD45+/CD3+/CD4+/CD8+）和B管（CD 45+/CD 3-/CD 16+CD 56+/CD 19+）中，再分别向A、B两管中加人10 0 l新鲜EDTA抗凝静脉血，涡旋混匀，室温避光放置15min，然后分别向两管中加入溶血素50 0 l，涡旋混匀，室温避光放置10min，然后每管加50 0 lPBS，室温平衡5min，充分涡旋混匀，2 h内上机检测（计数10 0 0 0 个细胞）。(3)结果判定：流式细胞仪计数每10 0 0 0 个细胞中标记细胞所占的百分比。1.2.4细胞因子检测清晨空腹状态下抽取受试者外周静脉血3ml至无菌试管，于室温下自然凝固，350 0 r/min离心10 min，取血清贮存于一8 0 冰箱以备用。采用酶联免疫吸附实验（ELISA)检测所有受试者血清IFN-、I L-4、I L-17 及TGF-1的含量，试剂采用武汉纯度生物，绘制标准曲线图（以浓度标识为横坐标，吸光度标识为纵坐标），计算相第6 期2023年6 月第2 7 卷中国实验诊断学671应浓度。1.3纟统计学处理采用SPSS23.0统计学软件对所检测数据进行统计学分析，计量资料采用均数士标准差（土s）表示，组间比较采用方差分析，检验水准均取双侧=0.05，以P0.052.2HPV16/18型别及其他12 种型别在各病例组间所占的比例从CINI到SCC,随着宫颈病理分期进展，HPV16型及HPV18型所占比例逐渐升高，其他型别所占比例相对降低，差异有统计学意义(x=20.633,P0.05)，见表2。表2HPV16/18及其他12 种高危型阳性率在各病例间比较(%)组别nHPV 16/18其他CINI416(14.63)35(85.37)CIN I388(21.05)30(78.95)CINII3811(28.95)27(71.05)SCC3119(61.29)12(38.71)20.633P0.052.3外周血CD4+T细胞比例、CD8+T细胞比例及CD4+/CD8+比值在各组间比较情况与对照组相比，随着宫颈病变进展，CINI、CINI、CIN及SCC组外周血CD4+T细胞比例含量逐渐减低，CD8+T细胞比例逐渐升高，CD4+/CD8+比值逐渐减低，差异有统计学意义（P0.05），见表3。2.4血清IFN-、I L-4、I L-17 及TGF-1在各组间比较交与对照组相比，各组血清IFN-含量逐渐减低，IL-4、IL-17 及TGF-1含量逐渐升高，差异有统计学意义（P0.05），见表4。2.5不同型别高危型HPV感染者血清IFN-、I L-4、I L-17 及TGF-1水平比较高危型HPV16/18与其他型别感染组比较，血清IFN-含量减低IL-4、I L-17 及TGF-1含量升高，差异有统计学意义(P0.05）,见表5。表3CD4+T、CD 8+T 及 CD4/CD8在各组间比较情况(x士s,%)组别CD4+CD8+CD4+/CD8+CG42.124.1228.213.561.520.27CINI39.093.3030.854.231.290.21CINI37.463.6632.064.611.190.23CINII35.103.9134.993.931.040.19SCC32.474.1838.392.780.860.14F33.40635.35148.560P0.050.050.053讨论高危型HPV感染是宫颈癌前病变及宫颈癌发生、发展的主要危险因素之一 12 ，大部分女性在其一生中都不止一次感染过HPV,其中绝大部分表现为一过性感染，大多数病损能够自行消退。有相关数据显示 13，两年内有约90%的HPV感染能够进行自我清除，能发展为恶性肿瘤的HPV感染不足1%。近年来研究表明机体的免疫系统尤其是CD4+T细胞介导的细胞免疫在抗HPV感染中发挥了重要作用，而Th1/Th2、T h 17/T r e g 为Th细胞主要类型，成为高危型HPV感染导致宫颈病变及宫颈癌的免疫机制研究热点之一。：本研究中随着宫颈病变进展，高危型HPV感染者CD4+T淋巴细胞逐渐减低，而CD8+T淋巴细胞逐渐上升，这提示患者体内存在T淋巴细胞亚群偏移现象，且CD4+/CD8+逐渐降低，SCC组CD4+/CD8+比值 1,提示患者可能处于免疫抑制状态，这将会使宿主不能将肿瘤细胞有效地清除，从而有利于肿瘤细胞在机体内增殖而导致癌症扩散。Th1/Th2、T h 17/T r e g 型细胞因子通过表达相关转录因子来参与细胞免疫。Th1细胞通过表达转录因子T-bet、ST A T-4分泌IFN-、T NF-、IL-2等细胞因子来参与细胞免疫 14。其中IFN-主要是Th1细胞产生的一种重要要的免疫调节因子，在激活细胞免疫、刺激抗肿瘤免疫反应中起关键作用 15。Th2细胞通过表达转录因子GATA-3和STAT-6分泌IL-4、I L-5、I L-6 和IL-13等细胞因子参与细胞免疫 16 。其中IL-4被称为“典型的免疫调Chin J Lab Diagn,June,2023,Vol 27,No.6672表4各组血清IFN-、IL-4、IL-17 及TGF-1比较（x士s，p g/m l)组别nIL-4IFN-IL-17TGF-1CG4032.175.93806.2687.61279.9357.2519.474.74CINI4136.094.81739.7195.44314.3152.4822.604.79CIN I3837.536.37710.67101.78327.5957.8424.645.61CIN II3842.145.66657.73108.84361.0667.8428.174.69SCC3147.015.33593.5999.89413.6650.4337.265.63F36.27123.89426.96461.569P0.050.050.050.05表5不同型别高危型HPV感染者血清IFN-、IL-4、IL-17 及TGF-1水平比较（x士s,pg/ml)型别IL-4IFN-IL-17TGF-1高危型HPV16/1843.876.05662.40112.05376.4967.9233.436.49其他38.186.11739.4996.20344.3256.4124.065.29t5.2024.2392.989.187P0.050.050.050.05节细胞因子”,在抗肿瘤免疫、调节抗体产生以及效应性T细胞反应的发展中起着重要作用 17 。本研究结果显示：从CINI到SCC,随着宫颈病理分期的进展，血清IFN-含量逐渐降低，而IL-4含量逐渐升高，说明高危型HPV感染可以促进Th2细胞因子表达，并降低Th1细胞因子表达，破坏Th1/Th2之间平衡，从而导致机体免疫力下降和宫颈病变程度加重，与Deligeorogloul181研究结果一致。Th17细胞是介导炎症反应的主要炎症细胞，IL-17是其分泌的重要炎症介质。研究表明 19,IL-17在感染性疾病、自身免疫性疾病发生发展过程中发挥重要作用；研究表明Th17细胞分泌的白细胞介素17(IL-17)与肿瘤生长和病毒感染的持续性有关，高危型HPV感染主要刺激系统性IL-17的产生，同时减少局部表达 2 0 。Treg细胞具有免疫抑制性，是抑制反应性T细胞免疫反应的细胞，Treg细胞参与了CC、乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展过程，可作为恶性肿瘤病情进展的评估指标 2 1-2 。TGF-1是由Treg细胞分泌产生的细胞因子，作为多功能细胞因子参与细胞的增殖、分化、免疫功能等细胞调节，其主要通过免疫细胞介导下调机体免疫应答反应。高危型HPV癌基因E7通过TGF-/Smad途径上调宫颈癌中miR-182的表达 2 3。有研究显示TGF-1表达的改变是HPV相关宫颈癌形成的重要机制，同时在多种癌症疾病中均有高表达 2 4。Chatterjee S等研究表明TGF-1通过转录因子STAT1调节途径增加高危型HPV感染致宫颈癌进展的敏感性 2 5。本研究结果表明：随着宫颈病理分期进展，IL-17、T G F-1含量逐渐升高，尤其SCC组TGF-1含量显著高于正常，可见高危型HPV感染伴宫颈病变及SCC会导致Th17/Treg细胞相关炎症细胞因子之间动态平衡破坏，导致高危型HPV在机体出现免疫逃逸。本研究HPV16/18型在SCC中的比例为6 1.2 9%，随着宫颈病变程度的加重，HPV16/18型别所占比例越来越高，其他型别所占比例相对减低，且与其他型别高危型HPV感染相比，HPV16/18感染者血清IFN-含量减低，而IL-4、I L-17、T G F-1含量增高，这可能与HPV16/18型致癌蛋白的致癌能力的强弱有关，HPV16/18感染是导致宫颈癌的主要原因。总之，Th1/Th2、T h 17/T r e g 免疫因子在CIN及宫颈癌发生、发展的多个环节中发挥着重要的调节作用，通过本研究以期为宫颈高危型HPV感染伴宫颈病变及宫颈癌的免疫治疗提供一个新的思路。参考文献：1JQian L,Zhang Y,Cui D,et al.Analysis of epidemiological trendsin human papillomavirus infection among gynaecological outpa-tients in 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